为什么二代测序的原始数据中会出现Read重复现象?

要搞清楚这个read重复(duplicate)的问题,我想我们需要从NGS数据的产出过程说起,具体来说如下:

  1. 基因组DNA提取;
  2. DNA随机打断,最常用的是超声打断;
  3. 对被打断的DNA片段进行末端修复(通常是3'加A),然后在两端加接头,选择特定长度的片段文库进行PCR扩增(通过PCR的扩增会选!择!性!地提高加上了接头的文库分子数量);
  4. 文库上机与测序芯片(Flowcell)上的引物结合,经过桥式PCR扩增,在芯片上形成测序所需的cluster;
  5. 进行SBS测序,光学信号捕获,生成序列。

我们一般认为第1步DNA提取出来的是完整的基因组,打断则是完全随机的——通常来说也确实如此。

在第3步,PCR扩增时,同一个DNA片段会产生多个相同的拷贝,第4步测序的时候,这些来源于同!一!个!拷贝的DNA片段会结合到Fellowcell的不同位置上,生成完全相同的测序cluster,然后被测序出来,这些相同的序列就是duplicate。这是duplicate的第一个来源,也是主要来源,称为PCR duplicates(PCR重复)。

同样,在第4步,生成测序cluster的时候,某一个cluster中的DNA序列可能搭到旁边的另一个cluster的生成位点上,又再重新长成一个相同的cluster,这也是序列duplicate的另一个来源,这个现象在Illumina HiSeq4000之后的Flowcell中会有这类Cluster duplicates,这是第二类duplicate(如下图)。

在第5步中,某些cluster在测序的时候,捕获的荧光亮点由于光波的衍射,导致形状出现重影(如同近视散光一样),导致它可能会被当成两个荧光点来处理。这也会被读出为两条完全相同的reads,这是第三类duplicate,称之为Optical duplicates(光学重复);

 
 

以上三种比较常见,还有第四种,称为Sister duplicates,这是比较特殊的一个情况。它是文库分子的两条互补链同时都与Flowcell上的引物结合分别形成了各自的cluster被测序,最后产生的这对reads是完全反向互补的。比对到参考基因组时,也分别在正负链的相同位置上,在有些分析中也会被认为是一种duplicates。

另外,据说 NextSeq 平台上还出现过由于荧光信号捕获相机移动位置不够,导致 tile 边缘被重复拍摄,每次采样区域的边缘由于重复采样而出现了duplicates,下图中蓝色点代表 duplicates,可以看到在tile的左右两侧明显富集。

 
 

以上,除了NextSeq的情况之外,所有这些不同类型的duplicates都各有特点。比如PCR duplicate的特点是随机分布于Flowcell表面;而cluster duplicates和optical duplicates 的特点是它们都来自Flowcell上位置相邻的cluster。Cluster的位置一般都会被记录在原始测序fastq文件@Sequence-id那一行中。

这些Read重复都会一定程度上导致一些碱基信号被错误地拉高或者减低,会对后续分析带来干扰,特别是在WGS和WES分析时都需要去除。如果测序过程没什么特殊问题或者原因,那么,测序数据的duplicate比例一般都在10%以下。

另外,PCR duplicates可以通过PCR-free来避免。并且PCR本身还会带来一些其他的问题,比如扩增过程自带了一定的偏向性,这会损失一定的测序随机性,使得某些序列信息被扩大或者减小。所以,只要DNA起始量足够,那么我们就应该尽量采用PCR Free的方式来建库。

作者:黄树嘉
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