测序原理 - PacBio技术资料

手头有一套完整的PacBio技术资料，会慢慢的总结到博客上。

写在前面：PacBio公司主要有两个测序平台一个是RS，一个是最新的Sequel，下面如果没有指明则是在讲RS平台。

SMRT测序技术总览（SMRT® Sequencing Technology Overview）

首先必须对下面几个东西形成概念：

1.SMRT Cell：纳米制造的，不可回收的消耗品，每个 cell 里有 1M 的well（即ZMW），ZMW是单分子实时测序的最小场所。

Sequel SMRT Cell 1M are nano-fabricated纳米制造 consumables消耗品 patterned with附有图案 1,000,000 wells called zero-mode waveguides零模波导孔 (ZMWs). The structure of the ZMW is unique, as it enables real-time sequencing observation. They are packaged together in a streamlined流线型 4 SMRT Cell format (4/tray托盘). One SMRT Cell is utilized in each sequencing reaction, and experiments can be run on a single SMRT Cell or in batch批 mode, giving your projects a greater level of flexibility.

2.SMRT得到的初始信号是什么？（Signal Processing and Base Calling）

最初得到的是光学信号，需要将光学峰转化为碱基（Converting pulses of light into DNA bases and kinetic measures）

3.SMRTbell：样品准备时，会用到SMRTbell的Adapters

4.测序：在Adapters处加上DNA聚合酶和引物，复制就开始了

5.不同建库下的不同结果（Two Ways to Utilize PacBio® Long Readlengths）

一种是插入片段很长（>2kb，通常是为了denovo组装），这时由于读长限制只能测一个pass（两个Adapters之间就是一个pass）

一种是插入片段很短（<2kb，通常为转录组），这时就会测出多个pass，因而产生CCS，可以进行校正（错误率可降至1%以下）。

6.测序后reads的长度分布和校正准确度（Exponential Read Length Distribution and Consensus Accuracy）

7.C2 Chemistry的结果（Typical Results with C2 Chemistry）

8.实时动态信息（Kinetic Information）

SMRT技术可以实时的测出DNA链上的各种碱基类型（修饰和未修饰）（Epigenetics, DNA damage, new, novel modifications）

9.总结

SMRT单分子实时测序，会测出很长的reads，有多种方式来利用reads的长度（CLR和CCS）

没有扩增偏向，二代技术在GC含量异常区域会明显的测不准，而PacBio技术则没有任何偏向

能读出DNA链上的所有信息（表观），只要你能识别分离出信号的意义