单细胞测序最好的教程（十四）测序原始数据公开至NCBI数据库

作者按

国内对于单细胞测序相关的中文教程确实不够全面，当然NCBI官网给的上传教程也比较详细了，所以变成了会者不难。本教程你现在可能用不上，但是你如果做单细胞测序，那么未来你一定会用上，建议收藏。

在这里，我们将演示如何将测序文件完整上传到NCBI上。本教程首发于单细胞最好的中文教程，未经授权许可，禁止转载。

全文字数|预计阅读时间: 3500|5min

——星夜老师

1. 注册NCBI账户

我们首先打开SRA的上传官网：https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra/，注册一个账户

注意

不能使用163，qq邮箱之类的，可能会收不到邮件

2. 新建SRA提交

2.1 选择Biosample

我们首先需要准备biosample，这个是需要ncbi官网审核的，每一个biosample代表了一个真实的样本。

2.2 填写信息

一般来说，我们可以指定一个数据的释放日期，我估计一年的时间论文应该能发出去，所以设置到了明年同一时间。

下拉选择人类资源Human

在这里，我们选择文件上传的方式进行填写

文件大概长这个样，绿色是必填项，黄色是可选项，你也可以添加自己的属性。不过需要注意的是，对于不同的sample_name，后面的属性不能完全一致，即使是同一种病，建议把病人来源标上，这样就能不重复了。

我们提交后出现这个页面，等待管理员审核即可。

3. 上传fastq

3.1 biosample获取

经过三天的等待，我们的fastq的上传审核终于完成了

我们点击manage data发现多了30个biosample可以进行上传，这里的Accession就是我们的biosample的id，每个样本唯一。

3.2 上传SRA数据

我们点击上一个页面的Sequence Read Archive，准备上传fastq

由于我的数据在服务器上，所以我们选择命令行上传

点击Request preload folder，ncbi提供了详细的上传教程

3.3 ascp环境安装

直接使用conda安装ascp，避免各种无意义的不兼容与报错。因为ascp的安装需要特定的glibc版本。

conda create -n ascp python=3.8

conda activate ascp

conda install -c hcc aspera-cli -y

ascp -h #检查安装

准备好ascp环境后，我们选择开始构建SRA项目

3.4 SRA上传内容填写

构建的过程比较简单，我们需要输入每一列所对应的信息即可，这里提供一个例子

biosample_accession	library_ID	title	[library_strategy](#'Library and Platform terms'!A2)	[library_source](#'Library and Platform terms'!A27)	[library_selection](#'Library and Platform terms'!A36)	library_layout	[platform](#'Library and Platform terms'!A66)	instrument_model	design_description	filetype	filename	filename2	filename3	filename4	filename5	filename6	filename7	filename8	assembly	fasta_file
SAMN36786***	Name	RNA-seq of Homo sapiens: Decidua	RNA-Seq	TRANSCRIPTOMIC SINGLE CELL	RANDOM	paired	ILLUMINA	Illumina NovaSeq 6000	Single cell 10X	fastq	***_1_1_R1.fq.gz	***_1_1_R2.fq.gz	***_2_1_R1.fq.gz	***_2_1_R2.fq.gz	***_3_1_R1.fq.gz	***_3_1_R2.fq.gz	***_4_1_R1.fq.gz	***_4_1_R2.fq.gz

其中，你下载的excel里面有很多是可以选的，所以我加粗的才是需要自己填写而不法选择的。

biosample_accession: 生物样本访问号
library_ID: 库ID，这个是独一无二的，需要自己想好用什么ID存在SRA数据库
title: 数据标题，这个标题就任意，但是一般规则是RNA-seq of 物种：组织
library_strategy: 库构建策略，这里一般是RNA-seq
library_source: 数据来源库，这里一般是TRANSCRIPTOMIC SINGLE CELL
library_selection: 库选择方式，这里一般是RANDOM
library_layout: 库布局，我这里是双端测序，所以写paired
platform: 测序平台，我从测序公司给的文件里找到了Illumina
instrument_model: 仪器模型，我从测序公司给的文件里找到了Illumina NovaSeq 6000
design_description: 设计描述，我们是单细胞测序所以是Single cell 10X
filetype: 文件类型，我们上传的文件类型，这里一般都是fastq
filename: 文件名（第1个文件）一般一个单细胞文库最大是8个文件，双端测序的话最小是2个文件，大部分都是两个文件，取决于测序公司给你的结果。
filename2: 文件名（第2个文件）
filename3: 文件名（第3个文件）
filename4: 文件名（第4个文件）
filename5: 文件名（第5个文件）
filename6: 文件名（第6个文件）
filename7: 文件名（第7个文件）
filename8: 文件名（第8个文件）

3.5 上传本地fastq

填好这个表后，我们点击continue，进入文件上传页面，跨洲际上传，这里只介绍ascp，以下命令是从官网复制的，切记不可照抄

ascp -i /mnt/home/zehuazeng/ncbi/aspera.openssh -QT -l100m -k1 -d /mnt/home/zehuazeng/media/207D/origData subasp@upload.ncbi.nlm.nih.gov:uploads/starlitnightly_163.com_***

这里需要修改的只有-i和-d两个参数，注意是绝对路径

-i: openssh文件路径，这个是在上传页面有一个超链接可以下载
-d: 需要上传的文件夹，里面只需要包含你要传的fq文件即可，文件名与前面填的filename1-8一致。

由于网络波动，所以我写了一个.sh文件，检测到上传失败可以自动重传，我们命名该文件为upload.sh

#!/bin/bash

while true; do

    ascp -i /mnt/home/zehuazeng/ncbi/aspera.openssh -QT -l100m -k1 -d /mnt/home/zehuazeng/media/207O/origData8 subasp@upload.ncbi.nlm.nih.gov:uploads/starlitnightly_163.com_UFgOBYes

    if [ $? -eq 0 ]; then

        echo "Command completed successfully."

        break

    else

        echo "Command failed. Retrying in 5 seconds..."

        sleep 5

    fi

done

然后在终端输入./upload.sh即可运行，注意文件需要先修改权限chmod 777 ./upload.sh。

我们发现自动上传便开始了，并且会自动检测上传成功与失败。我们等全部文件上传好后，回到刚才的SUB页面

我们选择Select preload folder，这里origData7是我们已经传好的文件夹，而origData8是正在上传的文件夹

选择完了我们点击Continue，就会跳到最后一个页面，一般来说文件会自动帮你选出来，根据你前面填写的filename1-8

我们点击Submit就好了，会跳转到最开始的页面，提示我们正在处理中。

3.6 其他

我在上传的时候遇到了一次失败，报错提示是

2023-08-06T22:03:02 sra_subprocess error: Finished: /panfs/traces01.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/trace_software/pipeline/sra_prod/transform_tools/sharq_load.py --config /panfs/traces01.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/trace_software/pipeline/sra_prod/config.sra.public /panfs/traces01.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/trace_software/pipeline/sra_prod/transform_tools/sharq --platform=ILLUMINA --log-level=info --output=/export/home/SSD/production_sra_public/sge1240.212826.trace.run_load.sh/SRR25541***.run_load/SRR25541***.output ***_3_1_R2.fq.gz ***_4_1_R2.fq.gz ***_2_1_R2.fq.gz ***_2_1_R1.fq.gz ***_1_1_R1.fq.gz ***_1_1_R2.fq.gz ***_3_1_R1.fq.gz ***_4_1_R1.fq.gz; pid=218120, rc=243

这种错误不是我能解决的，于是我写了封邮件发送到sra@ncbi.nlm.nih.gov，然后过了两天再看邮箱，工作人员后台已经帮我弄好了。

4. GEO上传

我们将原始数据成功上传到SRA数据库后，我们还需要上传处理后的数据到GEO数据库上。GEO数据库与SRA的上传有一些类似，但也有所区别。可能是由于处理后的文件通常不会太大，所以上传可以用ftp。

4.1 新建GEO提交

我们点击New Submission新建一个提交

我们选择high-throughout sequencing来完成scRNA-seq数据的上传，点开后发现，我们需要先下载一个meta文件进行信息的填写。

我们选择第二个，因为我们已经把测序文件上传到了SRA数据库，这样可以避免重复上传原始数据。

我们照着EXAMPLE的格式填写即可。

4.2 上传处理文件与meta

然后我们点击Create personalized upload space创建自己的ftp空间

等待一会儿便会加载出Step 2，我们点击左边的箭头展开，会发现里面提供了GEO数据库的服务器信息。

Host address:
username
password

我们根据这三个信息可以连接到远程的GEO服务器上，但需要注意的是，我们连接的远程目录不能是默认的，而是uploads/starlitnightly_***这个在图中我用红色区域圈了起来

我是mac系统，所以我用transmit来做ftp文件传送,我们将刚才的Hostname填到地址，username填到用户名，password填到密码，同时设定远程路径为刚刚提到的uploads/starlitnightly_***

连接后我们会发现里面是空的，我这里需要传过滤后的h5文件以及velocyto生成的剪接/未剪接矩阵，所以我新建了两个文件夹，一个叫h5_file，一个叫loom_file，同时我在meta里面已经填写好了每一个样本对应的文件名

我们直接拖动文件进入对应文件夹即可上传。同时需要注意的是，meta文件也需要一并上传

4.3 提交GEO申请

我们在传好文件后，回到GEO申请界面，点击Notify GEO，我们填写好目录和文件描述，点击submit即可。

4.4 确认GEO

大概一天左右（工作日），你就会收到一封来自GEO工作人员的审核邮件，如果有问题会在邮件里说明，我这里没有问题就直接回道GEO里查看我的提交，发现确实多了一个记录。

我们点进去后，可以点击Update更新一些相关信息。