ANNOVAR工具

annovar软件组件介绍之一——table_annovar.pl（译）

对于初学者，使用ANNOVAr的最简单方法是使用table_annovar.pl程序，该程序采用输入突变文件（例如，VCF文件）并生成带有多个制表符分隔的输出文件，每个列表示一组注释。另外，如果输入是VCF文件，则程序还生成新的VCF输出文件，其中INFO字段填充有注释信息。

假设我们已经下载了ANNOVAR包并使用tar zxvf annovar.latest.tar.gz解压缩包。您将看到bin/目录包含有多个.pl后缀的Perl程序。（注意，如果您已将ANNOVAR路径添加到系统可执行文件路径中，则键入annotate_variation.pl即可，而不是键入perl annotate_variation.pl。首先，我们需要使用annotate_variation.pl下载相应的数据库文件，然后我们将运行table_annovar.pl程序来注释example/ex1.avinput文件中的突变。

[yhwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb -webfrom annovar refGene humandb/

[yhwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb cytoBand humandb/

[yhwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb -webfrom annovar exac03 humandb/

[yhwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb -webfrom annovar avsnp147 humandb/

[yhwang@biocluster ~/]$ annotate_variation.pl -buildver hg19 -downdb -webfrom annovar dbnsfp30a humandb/

[yhwang@biocluster ~/]$ table_annovar.pl example/ex1.avinput humandb/ -buildver hg19 -out myanno -remove -protocol refGene,cytoBand,exac03,avsnp147,dbnsfp30a -operation gx,r,f,f,f -nastring . -csvout -polish -xref example/gene_fullxref.txt

输入文件包含多个列，前几列是您的输入列，以下每个列对应于用户在命令行中指定的“协议”之一。Func.refGene, Gene.refGene, GeneDetail.refGene, ExonicFunc.refGene, AAChange.refGene列包含关于突变如何影响基因结构的各种注释。Xref.refGene列包含基因的交叉引用；在这种情况下，已知的遗传疾病是否是由该基因的缺陷引起的（该信息在命令行的示例/gene_fullxref.txt文件中被填充）。对于接下来的几列，ExAC *列表示所有样本中的等位基因频率以及Exome Aggregation Consortium数据集中的子群体，而avsnp147表示dbSNP 147版本中的SNP标识符。其它列包含预测非同义突变使用几种广泛工具的得分，PolyPhen2 HDIV得分、PolyPhen2 HVAR得分，LRT得分，MutationTaster得分，MutationAssessor得分，FATHMM得分，GERP ++得分，CADD得分，DANN得分，PhyloP得分和SiPhy得分等等。

我们可以更加详细地检查命令行。-operation参数指定ANNOVAR每个协议使用哪些操作：g表示基于基因，gx表示基于基因的交叉引用注释（来自-xref参数），r表示基于区域，f表示基于过滤器。如果您不提供外部参考文件，则操作只能是g。您将在其他网页中找到有关基因/区域/基于过滤器的注释的详细信息。有时，用户需要制表符分隔文件而不是逗号分隔文件，删除上述命令的-csvout参数就可以完成。

在上面的命令中，我们使用-xreffile参数为基因组提供注释。如果文件包含标题行，则可以为基因提供多个注释（而不仅仅是一个列）。为了说名这一点，我们可以检查example/gene_fullxref.txt文件的前两行（包括标题行）。

[yhwang@biocluster ~/project/annotate_variation]$ head -n 2 example/gene_fullxref.txt

#Gene_name      pLi     pRec    pNull   Gene_full_name  Function_description    Disease_description     Tissue_specificity(Uniprot)     Expression(egenetics)  Expression(GNF/Atlas)    P(HI)   P(rec)  RVIS    RVIS_percentile GDI     GDI-Phred

A1BG    9.0649236354772e-05     0.786086131023045       0.2138232197406 alpha-1-B glycoprotein  .       .       TISSUE SPECIFICITY: Plasma.;    unclassifiable (Anatomical System);amygdala;prostate;lung;islets of Langerhans;liver;spleen;germinal center;brain;thymus;       fetal liver;liver;fetal lung;trigeminal ganglion;       0.07384 0.31615 -0.466531444    23.51380042     79.3774 1.88274

标题行以#开头。然后，交叉引用文件包含15种基因注释。您可以运行上面的相同命令，结果文件可以从此处下载。下面显示了部分文件，为用户提供了一个示例：

table_annovar.pl可以直接支持VCF文件的输入和输出（注释将被写入输出VCF文件的INFO字段）。我们试试这个：

[yhwang@biocluster ~/]$ table_annovar.pl example/ex2.vcf humandb/ -buildver hg19 -out myanno -remove -protocol refGene,cytoBand,exac03,avsnp147,dbnsfp30a -operation g,r,f,f,f -nastring . -vcfinput

您可以在此处下载输出文件：ex2.hg19_multianno.vcf。此外，制表符分隔的输出文件也可以（例如， ex2.hg19_multianno.txt），其中包含不同格式的类似信息。您可以在文本编辑器中打开新的VCF文件，并检查文件中已更改的内容：VCF文件中的INFO字段现在包含您需要的注释，以字符串ANNOVAR_DATE开始，ALLELE_END结束。如果多个等位基因位于同一个基因座中，您将在INFO字段中看到多个此类符号。屏幕截图如下所示：

annotate_variation.pl

annotate_variation.pl程序是ANNOVAR中的核心程序。 我们可以转到ANNOVAR目录，然后逐个运行以下三个命令。

annotate_variation.pl -geneanno -dbtyep refGene -buildver hg19 example/ex1.avinput humandb/

annotate_variation.pl -regionanno -dbtype cytoBand -buildver hg19 example/ex1.avinput humandb/

annotate_variation.pl -filter -dbtype exac03 -buildver hg19 example/ex1.avinput humandb/

这三个命令分别对应于基于基因、基于区域和基于过滤器的注释。

第一个命令注释ex1.avinput文件中的12种突变，并将它们分类为intergenic、intronic、non-synonymous SNP、feameshift delete、large-scale duplication等。

检查ex1.avinput文件以查看简单文本格式，每一行对应一个突变。花费几秒钟完成注释，生成两个输出文件为ex1.avinput.variant_function和ex1.avinput.exonic_variant_function。检查example/目录中的两个输出文件以查看它们包含的内容：在variant_function文件中，第一列和第二列注释突变对基因结构和受影响的基因，但其他列则从输入文件中重现。在exonic_variant_function文件中，第一，第二和第三列注释输入文件中的突变行号，突变对编码序列的影响和基因/转录本受到影响，但其他列从输入文件中复制。

接下来，该程序在ex1.avinput文件中注释突变，并为这些突变识别细胞遗传学带。注释过程应该小几秒钟。检查输出文件ex1.avinput.hg19_cytoBand以查看它包含的内容。第一列显示cytoBand，第二列显示注释结果，其他列从输入文件中再现。

接下来，程序识别ex1.avinput中exac03数据库中未观察到的突变子集（保存在ex1.avinput.hg19_exac03_filtered中）以及用等位基因频率观察到的突变子集（保存在ex1.avinput.hg19_exac03_dropped文件中）。

上述命令代表了一组关于ANNOVAR如何帮助研究人员宣传高通量测序数据产生的遗传变异的基本实例。

参考资料

ANNOVAR Guide