扩增子分析QIIME2-4分析实战Moving Pictures

本示例的的数据来自文章《Moving pictures of the human microbiome》，Genome Biology 2011，取样来自两个人身体四个部位五个时间点

 

进入环境

source activate qiime2-2017.8

退出环境

source deactivate

 

准备数据

# 创建并进入工作目录

mkdir -p qiime2-moving-pictures-tutorial
cd qiime2-moving-pictures-tutorial

# 下载实验设计（-O 重命名下载的文件）

wget -O sample-metadata.tsv https://data.qiime2.org/2017.6/tutorials/moving-pictures/sample_metadata.tsv

## 上面一步下载失败，可尝试删除空文件并使用我建立的备份链接下载；否则跳过下面两行命令

rm sample_metadata.tsv
wget http://bailab.genetics.ac.cn/markdown/sample-metadata.tsv

# 下载实验测序数据

mkdir -p emp-single-end-sequences
wget -O emp-single-end-sequences/barcodes.fastq.gz https://data.qiime2.org/2017.6/tutorials/moving-pictures/emp-single-end-sequences/barcodes.fastq.gz
wget -O emp-single-end-sequences/sequences.fastq.gz https://data.qiime2.org/2017.6/tutorials/moving-pictures/emp-single-end-sequences/sequences.fastq.gz

 

# 生成qiime需要的artifact文件(qiime文件格式，将原始数据格式标准化)

qiime tools import \
  --type EMPSingleEndSequences \
  --input-path emp-single-end-sequences \
  --output-path emp-single-end-sequences.qza

拆分样品

# 按barcode拆分样品Demultiplexing sequences

qiime demux emp-single \
  --i-seqs emp-single-end-sequences.qza \
  --m-barcodes-file sample-metadata.tsv \
  --m-barcodes-category BarcodeSequence \
  --o-per-sample-sequences demux.qza

 

# 结果统计

qiime demux summarize \
  --i-data demux.qza \
  --o-visualization demux.qzv

 

# 查看结果 (依赖XShell+XManager或其它ssh终端和图形界面软件)

qiime tools view demux.qzv

 

序列质控和生成OTU表

此步主要有DADA2和Deblur两种方法可选，推荐使用DADA2，去年发表在Nature Method上，比较同类方法优于其它OTU聚类结果；相较QIIME的UPARSE聚类方法，目前DADA2方法仅去噪去嵌合，不再按相似度聚类。比上一代分析结果更准确。

 

DADA2 

主要作用是去除低质量序列、嵌合体；再生成OTU表，现在叫Feature表，因为不再使用聚类方法，相当于QIIME时代100%相似度的OTU表。

读者思考时间：基于上面对拆分样品的统计结果，如何设置下面生成OTU表的参数。

 

–p-trim-left 截取左端低质量序列，我们看图中箱线图，左端质量都很高，无低质量区，设置为0；

–p-trunc-len 序列截取长度，也是为了去除右端低质量序列，我们看到大于120以后，质量下降极大，甚至中位数都下降至20以下，需要全部去除。

# 单端序列去噪, 去除左端0bp(--p-trim-left用于切除边缘低质量区)，序列切成120bp长；生成代表序列和OTU表；并重命名用于下游分析
qiime dada2 denoise-single \
  --i-demultiplexed-seqs demux.qza \
  --p-trim-left 0 \
  --p-trunc-len 120 \
  --o-representative-sequences rep-seqs-dada2.qza \
  --o-table table-dada2.qza
mv rep-seqs-dada2.qza rep-seqs.qza
mv table-dada2.qza table.qza

 

Deblur 

与DADA2二选一，用户可自行比较结果的差异，根据喜好选择

# 按测序质量过滤序列
qiime quality-filter q-score \
 --i-demux demux.qza \
 --o-filtered-sequences demux-filtered.qza \
 --o-filter-stats demux-filter-stats.qza
# 去冗余生成OTU表和代表序列；结果文件名有deblur，没有用于下游分析，请读者想测试的自己尝试
qiime deblur denoise-16S \
  --i-demultiplexed-seqs demux-filtered.qza \
  --p-trim-length 120 \
  --o-representative-sequences rep-seqs-deblur.qza \
  --o-table table-deblur.qza \
  --o-stats deblur-stats.qza

 

Feature表统计

qiime feature-table summarize \
  --i-table table.qza \
  --o-visualization table.qzv \
  --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv
qiime tools view table.qzv

 

代表序列统计

qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data rep-seqs.qza \
  --o-visualization rep-seqs.qzv
qiime tools view rep-seqs.qzv

 

建树：用于多样性分析

# 多序列比对
qiime alignment mafft \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --o-alignment aligned-rep-seqs.qza
# 移除高变区
qiime alignment mask \
  --i-alignment aligned-rep-seqs.qza \
  --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza
# 建树
qiime phylogeny fasttree \
  --i-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
  --o-tree unrooted-tree.qza
# 无根树转换为有根树
qiime phylogeny midpoint-root \
  --i-tree unrooted-tree.qza \
  --o-rooted-tree rooted-tree.qza

 

Alpha多样性

读者思考时间：下面多样性分析，需要基于标准化的OTU表，标准化采用重抽样至序列一致，如何设计样品重抽样深度参数。–p-sampling-depth

 

如是数据量都很大，选最小的即可。如果有个别数据量非常小，去除最小值再选最小值。比如此分析最小值为917，我们选择1080深度重抽样，即保留了大部分样品用于分析，又去除了数据量过低的异常值。

注：本示例为454时代的测序，数据量很小。现在一般采用HiSeq PE250测序，数据量都非常大，通常可以采用3万或5万的标准筛选，仍可保留90%以上样本。过低或过高一般结果也会异常，不建议放在一起分析。

# 计算多样性(包括所有常用的Alpha和Beta多样性方法)，输入有根树、Feature表、样本重采样深度(一般为最小样本数据量，或覆盖绝大多数样品的数据量)

qiime diversity core-metrics \
  --i-phylogeny rooted-tree.qza \
  --i-table table.qza \
  --p-sampling-depth 1080 \
  --output-dir core-metrics-results

# 输出结果包括多种多样性结果，文件列表和解释如下：

# beta多样性bray_curtis距离矩阵 bray_curtis_distance_matrix.qza 

# alpha多样性evenness(均匀度，考虑物种和丰度)指数 evenness_vector.qza

# alpha多样性faith_pd(考虑物种间进化关系)指数 faith_pd_vector.qza

# beta多样性jaccard距离矩阵 jaccard_distance_matrix.qza

# alpha多样性observed_otus(OTU数量)指数 observed_otus_vector.qza

# alpha多样性香农熵(考虑物种和丰度)指数 shannon_vector.qza

# beta多样性unweighted_unifrac距离矩阵，不考虑丰度 unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

# beta多样性unweighted_unifrac距离矩阵，考虑丰度 weighted_unifrac_distance_matrix.qza

 

# faith_pd算法统计Alpha多样性组间差异是否显著，输入多样性值、实验设计，输出统计结果

qiime diversity alpha-group-significance \
  --i-alpha-diversity core-metrics-results/faith_pd_vector.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --o-visualization core-metrics-results/faith-pd-group-significance.qzv

 

# 统计evenness组间差异是否显著

qiime diversity alpha-group-significance \
  --i-alpha-diversity core-metrics-results/evenness_vector.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --o-visualization core-metrics-results/evenness-group-significance.qzv

 

# 网页展示结果，只要是qzv的文件，均可用qiime tools view查看或在线https://view.qiime2.org/查看，以后不再赘述

qiime tools view core-metrics-results/evenness-group-significance.qzv

读者思考时间：实验设计中的那一种分组方法，与微生物群体的丰富度差异相关，这些差异显著吗？

 

解答：图中可按Catalogy选择分类方法，查看不同分组下箱线图间的分布与差别。图形下面的表格，详细详述组间比较的显著性和假阳性率统计。

结果我们会看到本实验设计的分组方式有Bodysite, Subject, ReportAntibioticUse，只有身体位置各组间差异明显，且下面统计结果也存在很多组间的显著性差异

 

Beta多样性

# 按BodySite分组，统计unweighted_unifrace距离的组间是否有显著差异

qiime diversity beta-group-significance \
  --i-distance-matrix core-metrics-results/unweighted_unifrac_distance_matrix.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --m-metadata-category BodySite \
  --o-visualization core-metrics-results/unweighted-unifrac-body-site-significance.qzv \
  --p-pairwise

 

# 按Subject分组，统计unweighted_unifrace距离的组间是否有显著差异

qiime diversity beta-group-significance \
  --i-distance-matrix core-metrics-results/unweighted_unifrac_distance_matrix.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --m-metadata-category Subject \
  --o-visualization core-metrics-results/unweighted-unifrac-subject-group-significance.qzv \
  --p-pairwise

 

# 可视化三维展示unweighted-unifrac的主坐标轴分析

qiime emperor plot \
  --i-pcoa core-metrics-results/unweighted_unifrac_pcoa_results.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --p-custom-axis DaysSinceExperimentStart \
  --o-visualization core-metrics-results/unweighted-unifrac-emperor.qzv

 

# 可视化三维展示bray-curtis的主坐标轴分析

qiime emperor plot \
  --i-pcoa core-metrics-results/bray_curtis_pcoa_results.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --p-custom-axis DaysSinceExperimentStart \
  --o-visualization core-metrics-results/bray-curtis-emperor.qzv

 

# 网页展示结果，或下载在线查看

qiime tools view core-metrics-results/bray-curtis-emperor.qzv

读者思考时间：按subject分组有显著区别吗？按body-site分组有显著区别吗？那些body-site组间存在区别？

按其它距离计算的结果，读者可以仔细看看不同距离矩阵计算结果的区别。个人感觉，一般比较好解释科学问题的方法就是适合的方法

 

物种分类

# 下载物种注释

wget -O gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza https://data.qiime2.org/2017.6/common/gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza

 

# 物种分类

qiime feature-classifier classify-sklearn \
  --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza \
  --i-reads rep-seqs.qza \
  --o-classification taxonomy.qza

 

# 物种结果转换表格，可用于查看

qiime taxa tabulate \
  --i-data taxonomy.qza \
  --o-visualization taxonomy.qzv

 

# 物种分类柱状图

qiime taxa barplot \
  --i-table table.qza \
  --i-taxonomy taxonomy.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --o-visualization taxa-bar-plots.qzv

# 网页展示结果，或下载在线查看

qiime tools view taxa-bar-plots.qzv

读者思考时间1：代表序列文件rep-seqs.qzv可视化结果中，可以下载fasta文件采用NCBI进行blast注释物种信息，与我们目前的结果比较，看看有什么不同，各分类级别的注释定义的相似程度是什么？ 

读者思考时间2：查看门水平(level2)分类结果柱状图，看每一类body-site中主要丰度的门类是什么？

 

差异丰度分析

差异丰度分析采用ANCOM (analysis of composition of microbiomes)，是2015年发布在Microb Ecol Health Dis上的方法，文章称在微生物组方面更专业，但不接受零值(零在二代测序结果表中很常见)。我个人一直用edgeR，感觉靠谱，因为高通量测序本质上是相同的

 

差异Features/OTUs分析

# OTU表添加假count，因为ANCOM不允许有零

qiime composition add-pseudocount \
  --i-table table.qza \
  --o-composition-table comp-table.qza

 

# 采用ancon，按BodySite分组进行差异统计

qiime composition ancom \
  --i-table comp-table.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --m-metadata-category BodySite \
  --o-visualization ancom-BodySite.qzv

 

# 查看结果

qiime tools view ancom-BodySite.qzv

读者思考时间：不同身体部分有那些Features存在丰度差异？那一组是最高或最低丰度？这此差异的Features属那些分类单元？

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差异分类学级别分析：以按门水平合并再统计差异

# 按门水平进行合并，统计各门的总reads

qiime taxa collapse \
  --i-table table.qza \
  --i-taxonomy taxonomy.qza \
  --p-level 2 \
  --o-collapsed-table table-l2.qza

 

# 同理去除零

qiime composition add-pseudocount \
  --i-table table-l2.qza \
  --o-composition-table comp-table-l2.qza

 

# 在门水平按取样部分分析

qiime composition ancom \
  --i-table comp-table-l2.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --m-metadata-category BodySite \
  --o-visualization l2-ancom-BodySite.qzv

读者思考时间：不同身体部分有那些Features存在丰度差异？那一组是最高或最低丰度？这此差异的Features属那些分类单元？ 

 

结果描述：结果的可视化(Visual)页面，一共分为三部分。

第一个表为ANCOM statistical results，只列出组间存在显著差异的门，其统计值W的计算及解释尚不清楚，查原始文章也没有找到。有待更新版中解释。

第二个表为各组的丰度分位数，就是箱线图的原始数据，为什么作者没有直接出图，我将与作者沟通讨论；目前可以比较各组的分布，来具体分析组间的差异，但不够直观；

统计各门类的火山图，坐标轴还没有详细解释，但其意思是越靠上越显著差异。此图采用Python的bokeh库生成的交互式图形，可以点击图中的点来查看具体的详细，如具体的分类学信息。相当于表1的可视化。

结果的网页还有其它页面，如peek页面可以查看此文件的基本信息，Provenance页面显示当前结果的生成过程图，点击过程中的点可以查看具体的程序和参数；链接按扭可以生成共享链接；下载按扭可以下载原始文件。