Next generation sequencing (NGS)二代测序数据预处理与分析

二代测序原理：

1、DNA待测文库构建。 超声波把DNA打断成小片段，一般200--500bp，两端加上不同的接头
2、Flowcell。一个flowcell，8个channel，很多接头
3、桥式PCR扩增。每个DNA片段将在各自位置集中成束，每一束含有单个DNA模板的很多拷贝，目的：将碱基的信号强度放大，达到测序所需的信号要求。
4、测序。边合成边测序。反应所需材料，dNTP的3’端特殊处理，不能继续反应，因此每次只能添加一个碱基，另外每个碱基有一种颜色。dNTP添加到链上后，所有未使用游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。

接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，

最后,   利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。

双端测序：正义链测100，反义链测100，合起来200，这样测序结果比较准确。

Next generation sequencing (NGS)二代测序数据预处理与分析

By zilhua | 2014 年 3 月 12 日

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常使用的工具列表

• 质量控制Quality Control：FastQC、Fastx-toolkit
• 拼接Aligner：BWA，Bowtie, Tophat, SOAP2
• Mapper：Tophat, Cufflinks
• 基因定量 Gene Quantification: Cufflinks, Avadis NGS
• 质量改进 Quality improvement: Genome Analysis Toolkit(GATK)
• SNP: Unified Genotyper,Glfmultiple, SAMtools, Avadis NGS
• CNV: CNVnator
• Indel: Pindel, Dindel, Unified Genotyper, Avadis NGS
• Mapping to a gene: Cufflinks, Rsamtools, Genomic Features

相关的数据格式

• FASTQ:
• SAM: A generic nucleotide alignment format
• BAM: binary format
• VCF

数据处理的流程

RNAseq数据不容易分析的原因：

• 差异大，0~几万
• 基因多
• 巨大的变异
• 样本量小
• 鉴定SNP可供借鉴的经验

鉴定SNP可供借鉴的经验

如果一个基因中SNP数目超过3个，10个碱基中SNP数目超过2个，这样的SNP就需要怀疑；

通过RNAseq、DNAseq鉴定SNP，有什么区别？

本质没有区别，但是RNAseq时，需要注意可变剪接 造成的SNP。

参考资料：

http://boyun.sh.cn/bio/?p=1862