知乎Live总结-重复nature文章笔记Single-cell

来自知乎Live-孟浩巍

1.文章重要技术及图讲解

首先在转录组RNA-seq中，有基因表达差异、基因融合、可变剪切、RNA单点突变。

在基因组中，单点变异、结构变异，CNV变异（拷贝数变异）

三类基本内容，主要是RNA-seq的分析。

从生物水平角度理解肺癌，掌握RNA-seq的建库流程 ，单细胞的建库流程和方法。

这个是通过热力图的方式，找出5种细胞中的特异性的gene marker，什么是基因标记，在某一个stage或者细胞内特异性表达的基因是基因marker。

0-15图标是取过log的fpkm，每一行是一个细胞的数据（约有80行），每一列一个基因的数据（有100+列）选取了100多个有代表性的基因。

左侧的rep1,2,3是聚类，是批次的意思。时间间隔大的叫做两个batch，同样的方法去做生物学重复叫repeat。每一个Repeat都有一个侧重点，根据颜色深度。颜色分布比较均匀说明不是因为聚类原因才导致的当前结果。

*是什么意思？表示相对应的细胞中的差异表达基因gene marker。

bp细胞可以分划为AT1和AT2细胞，导致基因表达谱逐渐发生变化，到6和4表达谱就完全不同了，包含了基因表达调控的过程。

灰色大括号：这个部分是两个Stage显著变化的基因。

①左边绿色的部分，在胚胎发育过程当中的14.5天，16.5天到成熟时期分别进行了RNA-seq；

②右上角的基因fpkm基因表达量，越深表达量越低，越亮表达量越高；

③最左边的颜色部分是为了区分细胞。Early progenitor(早期祖先)。

④每一行是一个单细胞，每一列是一个基因。那么同一细胞之间是有聚类在一起的。调过参数、使用trick选择部分基因，才让BP出现在中间的，AT1和AT2是由BP发展而来的。

启示：能做出来这个结果，客观上真假不能确定，这种参数条件下能出来这种结果。

⑤横轴底部是将细胞分成不同的时期。

是boxplot的补充，随着分化的进行。随着分化的进行，纵向是不同的细胞类型，横轴是不同的基因list。

————使用RNA-seq，提供了分化表达时的基因marker，给出了每个过程较重要的基因list。

建库做了100+个细胞；PCA分析；花了很多的heatmap并且用到了聚类方法；用到了GO分析；画了whilelink???

2.具体技术细节

建库方法1：成熟的mRNA有5'端的帽子和3'端的PolyA尾巴，直接对PolyA富集，那么就可以针对成熟mRNA了，但是这样就扔掉了很多不成熟的。

建库方法2：rRNA minus去除法。

核糖体主要分布在两个位置：糙面内质网和游离态，主要是在内置网上。

这个是核糖体的结构，黄色部分是rRNA，蓝色部分是核糖体蛋白。可以看出rRNA占了较大部分，核糖体蛋白主要是维持结构稳定。

//这个一开始看一脸懵，经过讲解看懂了。

左边是真核生物的rRNA，有一个大亚基和一个小亚基，其中大亚基是由5.8S,5S,28S这三种rRNA组成的，小亚基由18S rRNA组成的。

这四种亚基占细胞内RNA的比例99%以上，所以在建库时必须要去掉rRNA。

以上是部分关于建库的生物知识，下面是传统mRNA建库的正式的步骤：

Ⅰ.提取mRNA

1.使用Oligo dT磁珠对成熟的mRNA进行富集；

2.然后进行cDNA反转，就是根据mRNA得出互补的DNA基因片段；

3.打断成片段

4.加接头

5.进行PCR扩增

重点：3-4打断的过程，应该会不一般齐，有一个末端补平的过程，然后再加上一个A粘性末端，之后就可以加上测序的引物，引物是Y型的adaptor.

Ⅱ.rRNA minus方法

//这个听了两遍还是不太明白，是不是讲错了一点？

首先是将所有的RNA提取，然后是用磁珠将rRNA先去掉一遍，然后打碎，接上adaptor；转换成cDNA，如果此时还有rRNA，那么加入RNaseH进行消化掉，之后对加上引物cDNA进行扩增。

之后的过程就是一样了，这不就是建库完成了吗？~~~

//很不明白这是什么意思，为什么要测基因表达差异呢？有什么作用呢？？？

那么如何判断提取的RNA的质量呢？通过电泳图，如上。

最左边是Gene marker，接着从左到右依次是从好到坏，最好的就是左边第二条，最差的是最右边的。

有人提问如何去 tRNA，回答是由于长度的选择会将tRNA筛掉。（我怎么就没想到这个问题呢？还是水平不行。）

这个图是一个量化RNA提取水平，RIN（RNA完整数），需要有这些region和一些fragment。

下面给出了几个标准：

RIN越大越好，提取组完全没有降解，可以进行下一步。一般要求RIN7以上，低于则建库失败。

有人提问：如何判断提取的RNA中有没有被别的物种污染？

答：这个是需要进行比对的，测序之后的GCcontent是可以看出来的，如果比对不上那么就BLAST。

有人提问：那个rRNA去除的时候那个磁珠是可以特异结合rRNA的？

答：是特异结合的，有两步的去rRNA的，第一步就是磁珠，第二步是加入rRNA降解酶消化掉。（为什么这种问题我没有想到？其实我这个地方是不太明白的，我的想法是以后有问题再百度，为什么我没有提出问题呢？。。。这就是差距，以及性格问题）

3.单细胞测序入门

分为两种：DNA水平测序；RNA水平测序。

比如本篇文章的五种，肺部细胞最终形成了5种：科普一下：

小肺泡细胞（I型）、大肺泡细胞（II型肺泡细胞）、肺巨噬细胞等等类型。

这几种细胞的基因表达都不同，这就是单细胞存在的意义，就是基因差异性表达呗！

比如在上图中右部有一个红块，细胞1中ABD基因表达，细胞2中ABC基因表达....如果一块测那么所有肯定是都表达。

下面是09年的早期single-cell的Rna-seq老师提出的方法：

提问：大家可以思考一下，为什么传统的RNA-Seq不能做单细胞？

//我刚入门，感觉一脸懵，不知道。

只要有富集的过程，效率都是非常低的，能富集到10%就非常多了。总之就是富集效率低！

细胞裂解-> 带有T的primer直接进行cDNA反转-> 再加上polyA-> 再合成UP2-> 使用PCR扩增-> cDNA打断-> 绑定Adaptor-> 库扩增。

//为啥这里有一个cDNA的扩增呢？应该直接打断+adaptor，然后再PCR啊。

这里还是应该对cDNA有所学习：

与mRNA互补的DNA，是与RNA互补的单链DNA，在反转录酶的作用下合成的；合成完之后再在碱作用下去掉RNA，再合成双链cDNA，与原来基因中的DNA不同而且没有内含子！

这个就是cDNA双链的合成过程，还是比较容易理解的!

**所有单细胞测序scRNA-seq的就是先反转再富集，一旦有富集就肯定做不到单细胞。

PCR扩增长度是有一定限制的（但是为什么为什么为什么？那里并没有打断就进行了PCR amplification呢？？？这不是相矛盾了吗？？？）

PCR扩增时有偏倚bias，它偏向于扩增GC含量高的。

下面是smart-seq的过程：

就是上边这个过程了，多加一个ployA，合成时加了一个CCC，之后用特殊酶Tn5直接会识别4个碱基并加上Adaptor，　　

接下来的过程和RNA-seq还是差不多的，首先是质控，mRNA前处理，回帖（也就是比对），计算不同基因表达量，比较差异表达。

有个人提问：全程没有rRNA去除的步骤，是不是pcr扩增mRNA之后rRNA被稀释了？（我为什么没想到，之前你想想建库的时候不就是苦于rRNA过多吗???）

答:+adaptor其他的序列是加不上的，所以建库是建不了rRNA的。（感觉live主这个回答的有点水，不具体）

//有可能是只有有一个polyA的才能再加一个polyA ???我是这么理解。