【转录组入门】6：reads计数

作业要求：

实现这个功能的软件也很多，还是烦请大家先自己搜索几个教程，入门请统一用htseq-count，对每个样本都会输出一个表达量文件。
需要用脚本合并所有的样本为表达矩阵。参考：生信编程直播第四题：多个同样的行列式文件合并起来
对这个表达矩阵可以自己简单在excel或者R里面摸索，求平均值，方差。
看看一些生物学意义特殊的基因表现如何，比如GAPDH,β-ACTIN等等。

【1】安装计数软件：htseq-count

 # conda安装
 $ conda install -c bioconda htseq

 # 测试
 # 能够在Python中导入HTSeq这个包，说明安装成功
 $ python
 >>> import HTSeq
 >>> 

【2】用htseq对排序后的bam文件进行计数

 # 用htseq对排序后的bam文件进行计数
 # htseq-count [options] <alignment_file> <gtf_file>
 for i in `seq  `
 do
       htseq-count -s no -r pos -f bam RNA-Seq/aligned/SRR35899${i}_sorted.bam reference/gencode.v26lift37.annotation.sorted.gtf > RNA-Seq/matrix/SRR35899${i}.count > RNA-Seq/matrix/SRR35899${i}.log
 done

 # （实际情况：没能对gtf文件进行排序，所以使用未排序的bam文件与原始gtf文件）
 for i in `seq  `
 do
     htseq-count -s no -r pos -f bam hisat2_result/SRR35899${i}.bam reference/genome/gencode/gencode.v26lift37.annotation.gtf > htseq-count_result/SRR35899${i}.count >log_SRR35899${i}_htseq
 done
   -f bam/sam： 指定输入文件格式，默认SAM
   -r name/pos: 你需要利用samtool sort对数据根据read name或者位置进行排序，默认是name
   -s yes/no/reverse: 数据是否来自于strand-specific assay。DNA是双链的，所以需要判断到底来自于哪条链。如果选择了no， 那么每一条read都会跟正义链和反义链进行比较。默认的yes对于双端测序表示第一个read都在同一个链上，第二个read则在另一条链上。

程序运行结束后得到矩阵文件：XXXXX.count

【3】合并表达矩阵

 # R脚本
 # . 导入数据
 # 首先将四个文件分别赋值：control1，control2，rep1，rep2
 >control1 <- read.table("~/disk2/data/rna-seq/matrix/SRR3589959.count", sep="\t", col.names = c("gene_id","control1"))
 >control2 <- read.table("~/disk2/data/rna-seq/matrix/SRR3589961.count", sep="\t", col.names = c("gene_id","control2"))
 >rep1 <- read.table("~/disk2/data/rna-seq/matrix/SRR3589960.count", sep="\t", col.names = c("gene_id","treat1"))
 >rep2 <- read.table("~/disk2/data/rna-seq/matrix/SRR3589962.count", sep="\t",col.names = c("gene_id","treat2"))
 # . 数据整合
 # 将四个矩阵按照gene_id进行合并，并赋值给raw_count
 >raw_count <- merge(merge(control1, contol2, by="gene_id"), merge(rep1,rep2, by="gene_id"))
 # 去掉前五行
 >raw_count_filter <- raw_count[-:-, ]
 # 因为我们无法在EBI数据库上直接搜索找到ENSMUSG00000024045.5这样的基因，只能是ENSMUSG00000024045的整数，没有小数点，所以需要进一步替换为整数的形式。
 # 第一步将匹配到的.以及后面的数字连续匹配并替换为空，并赋值给ENSEMBL
 >ENSEMBL <- gsub("\\.\\d*", "", raw_count_filter$gene_id)
 # 将ENSEMBL重新添加到raw_count_filt1矩阵
 > row.names(raw_count_filter) <- ENSEMBL
 # . 查看数据整体情况
 > summary(raw_count_filter)
 # . 将raw_count_filter写入csv文件（可用Excel文件）
 > write.csv(raw_count_filter,"d:/cs_file/r_file/file-lyx0623/H_N_rawcount.csv",row.names=FALSE)

理论知识

关于比对：

】想知道已知基因的表达情况：选择alignment-free工具（例如salmon, sailfish)

】想找noval isoforms：alignment-based工具（如HISAT2, STAR）

】转录本定量：需要考虑更多的因素

1、基因表达定量有3个水平：基因水平、转录本水平、外显子使用水平

基因水平：

Htseq-count等工具作用：根据read和基因位置的overlap，判断该read属于哪个基因

转录本水平：

Cufflinks等工具处理的难题：转录本亚型（isoforms）之间通常是有重叠的，当二代测序读长低于转录本长度时，如何进行区分？这些工具大多采用的都是expectation maximization（EM）。好在我们有三代测序。

外显子使用水平：与基因水平类似。为了更好的计数，需要提供无重叠的外显子区域的gtf文件，用于分析差异外显子使用的DEXSeq提供了一个Python脚本（dexseq_prepare_annotation.py）执行这个任务。

2、reads计数后得到的基因定量结果（count matrix），在进行不同维度的比较时需要进行不同的处理（标准化）：

【】比较同一个样本(within-sample)不同基因之间的表达情况---主要考虑转录本长度的影响

（因为转录本越长，那么检测的片段也会更多，直接比较等于让小孩和大人进行赛跑）

【】比较不同样本（across-sample）同一个基因的表达情况---主要考虑测序深度的影响

（测序深度越高，检测到的概率越大）

标准化的算法：RPKM（SE）, FPKM（PE），TPM, TMM，RSEM等等。

一般，标准化之后才能进行差异表达分析（某些软件要求原始数据，未经标准化）

htseq参数说明

用法：htseq-count  [options]  alignment_file  gff_file

alignment_file：比对结果文件，可以是sam格式或bam格式，可以通过后面介绍的-f参数指定，默认是sam格式。推荐使用按照name排序后的sam文件，这样的好处是消耗的内存更少，效率更高。关于输入文件排序详见参数-r。

gff_file: 包含单位信息的gff/GTF文件（gff文件格式），大多数情况下就是指注释文件; 由于GTF文件其实就是gff文件格式的变形，在这里同样可以传入GTF格式文件。

-f bam/sam： 指定输入文件格式，默认SAM

-r name/pos: 你需要利用samtool sort对数据根据read name或者位置进行排序，默认是name

-s yes/no/reverse: 数据是否来自于strand-specific assay。DNA是双链的，所以需要判断到底来自于哪条链。如果选择了no， 那么每一条read都会跟正义链和反义链进行比较。默认的yes对于双端测序表示第一个read都在同一个链上，第二个read则在另一条链上。

-a 最低质量， 剔除低于阈值的read

-m 模式 union（默认）, intersection-strict and intersection-nonempty。一般而言就用默认的，作者也是这样认为的。

-i id attribute: 在GTF文件的最后一栏里，会有这个基因的多个命名方式（如下）， RNA-Seq数据分析常用的是gene_id， 当然你可以写一个脚本替换成其他命名方式。