mRNA文库构建

Posted: 三月 27, 2017  Under: Transcriptomics  By Kai  no Comments

RNA-seq测序方法

  1. 在测mRNA过程中，首先要去除rRNA。以人为例，在抽提的总RNA中，95%的RNA是rRNA，2%的RNA是mRNA，剩下的则是lncRNA、microRNA、siRNA等。

  2. rRNA整个人类当中是非常保守的，在各个组织器官中也是非常稳定的，因此这些测序结果对我们的研究是没有用处的。mRNA则是RNA中比较重要的部分。

  3. Illumina公司的Truseq RNA建库方法是应用最广泛的一种，真核普通转录组为例：

    • 首先以mRNA的Poly(A)(高等生物特有的)这个特点，让带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，使mRNA和磁珠相结合在一起。
    • 接着回收磁珠，将带有Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。
    • 然后用镁离子溶液将洗脱下来的mRNA打成片段，被打断的mRNA片段用随机引物逆转录出第一链的cDNA，再合成出第二链，这样就有了双链cDNA。
    • 对双链cDNA末端修复，加A加接头。
    • 片段选择，PCR扩增、纯化（如果样本中存在污染物，则需要结合试剂盒进一步纯化）。

注：

  1. 这个建库方法对mRNA的完整性有较高要求，因此如果mRNA发生降解，那么磁珠只能吸附靠近3’端的mRNA断片，会在富集阶段被洗脱，导致最后数据有一定的偏差（在RNA测序质控时就能发现mRNA的3’端以及5’端是否有偏移）。

  2. 一般在会测序前对总RNA进行一次质检，根据电泳质检结果中的18S和28S（rRNA）两个峰的高度以及峰的尖度来判断RNA的质量，峰越高越尖（RIN > 8.0）表示RNA的完整度越好。

  3. 除了mRNA普通文库构建外，还有真核链特异性文库、lncRNA文库、SmallRNA文库等

  4. 针对一些FF(Formalin-Fixed)样本和FFPE(Paraffin-Embedded)石蜡包埋样本以及原核生物的总RNA中去除rRNA，不适合用上述mRNA建库方法。需要结合RiboZero、RiboMinus等来去除，其实是针对rRNA序列进行杂交捕获去除的原理来去除的。

以上主要参考陈巍学基因视频：
RNASeq方法及应用
http://blog.sciencenet.cn/blog-1333578-819475.html

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