简单使用DESeq2/EdgeR做差异分析

简单使用DESeq2/EdgeR做差异分析

Posted: 五月 07, 2017  Under: Transcriptomics  By Kai  no Comments

DESeq2和EdgeR都可用于做基因差异表达分析，主要也是用于RNA-Seq数据，同样也可以处理类似的ChIP-Seq,shRNA以及质谱数据。

这两个都属于R包，其相同点在于都是对count data数据进行处理，都是基于负二项分布模型。因此会发现，用两者处理同一组数据，最后在相同阈值下筛选出的大部分基因都是一样的，但是有一部分不同应该是由于其估计离散度的不同方法所导致的。

DESeq2的使用方法：

1. 输入矩阵数据，行名为sample，列名为gene；DESeq2不支持无生物学重复的数据，因此我选择了2个样本，3个生物学重复的数据；并对count data取整（经大神指点，这里需要说明下，我的测试数据readcount是RSEM定量的结果，并不是常见的htseq-count的结果，所以count值会有小数点，而DESeq2包不支持count数有小数点，所以这里需要round取整）。

   database_all <- read.table(file = "readcount", sep = "\t", header = T, row.names = 1)
   database <- database_all[,1:6]
   #type <- factor(c(rep("LC_1",3), rep("LC_2",3)))
   database <- round(as.matrix(database))

2. 设置分组信息以及构建dds对象

   condition <- factor(c(rep("LC_1",3), rep("LC_2",3)))
   coldata <- data.frame(row.names = colnames(database), condition)
   dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData=database, colData=coldata, design=~condition)

3. 使用DESeq函数进行估计离散度，然后进行标准的差异表达分析，得到res对象结果

   dds <- DESeq(dds)
   res <- results(dds)

4. 最后设定阈值，筛选差异基因，导出数据

   table(res$padj <0.05)
   res <- res[order(res$padj),]
   resdata <- merge(as.data.frame(res), as.data.frame(counts(dds, normalized=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE)
   write.csv(resdata,file = "LC_1_vs_LC_2.csv")

EdgeR的使用方法：

1. 跟DESeq2一样，EdgeR输入矩阵数据，行名为sample，列名为gene；DESeq2不支持无生物学重复的数据，因此我选择了2个样本，3个生物学重复的数据。

   exprSet_all <- read.table(file = "readcount", sep = "\t", header = TRUE, row.names = 1, stringsAsFactors = FALSE)
   exprSet <- exprSet_all[,1:6]
   group_list <- factor(c(rep("LC_1",3), rep("LC_2",3)))

2. 设置分组信息，去除低表达量的gene以及做TMM标准化

   exprSet <- exprSet[rowSums(cpm(exprSet) > 1) >= 2,]
   exprSet <- DGEList(counts = exprSet, group = group_list)
   exprSet <- calcNormFactors(exprSet)

3. 使用qCML（quantile-adjusted conditional maximum likelihood）估计离散度（只针对单因素实验设计）

   exprSet <- estimateCommonDisp(exprSet)
   exprSet <- estimateTagwiseDisp(exprSet)

4. 寻找差异gene(这里的exactTest函数还是基于qCML并且只针对单因素实验设计)，然后按照阈值进行筛选即可

   et <- exactTest(exprSet)
   tTag <- topTags(et, n=nrow(exprSet))
   tTag <- as.data.frame(tTag)
   write.csv(tTag,file = "LC_1_vs_LC_2_edgeR.csv")

Summary

以上我主要针对单因素两两比较组进行差异分析，其实DESeq2和EdgeR两个R包都可以对多因素进行差异分析。

1. DESeq2修改以上代码的分组信息design参数以及在差异分析results函数中添加所选定的分组因素，其他代码基本一样，具体参照DESeq2手册

2. EdgeR则需要用Cox-Reid profile-adjusted likelihood (CR)方法来估算离散度，y <- estimateDisp(y, design)或者分别使用三个函数（y <- estimateGLMCommonDisp(y, design)，y <- estimateGLMTrendedDisp(y, design)， ）y <- estimateGLMTagwiseDisp(y, design)；然后差异表达分析也跟单因素分析不同，主要使用generalized linear model (GLM) likelihood ratio test 或者 quasi-likelihood(QL) F-test，具体代码可以参照EdgeR手册。