RNA剪接体 Spliceosome | 冷冻电镜

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为什么冷冻电镜 (Cryo-EM) 技术的发明可以获得2017诺贝尔化学奖？知乎看法

Press release: The Nobel Prize in Chemistry 2017

We may soon have detailed images of life’s complex machineries in atomic resolution. 不久的将来，我们所有的生命复合体机器都能得到精确的原子层次的分辨结构。

Electron microscopes were long believed to only be suitable for imaging dead matter, because the powerful electron beam destroys biological material. But in 1990, Richard Henderson succeeded in using an electron microscope to generate a three-dimensional image of a protein at atomic resolution. This breakthrough proved the technology’s potential.

The desired atomic resolution was reached in 2013, and researchers can now routinely produce three-dimensional structures of biomolecules.

颜宁和施一公

一直不理解为什么施一公和颜宁等人的工作可以无限发表在CNS，基础的结构鉴定到底有什么意义？

RNA剪接体的结构鉴定为什么如此重要？

结构生物学和药物筛查有何联系？药物抑制蛋白都是通过结构来筛查药物的，蛋白结构至关重要。

Mechanistic Understanding of Pre-mRNA Splicing by the Spliceosome - 科普视频

RNA剪接

真核细胞中直接从DNA翻译得到的RNA是需要进行复杂的加工才能转变为成熟的mRNA的，初始的转录物包括了基因的全部序列（外显子和内含子）。那么将内含子从前体信使RNA中删除，就是RNA剪接的工作啦。RNA剪接的化学本质就是前体信使RNA经历两步转酯反应完成“剪”和“接”两个关键步骤，而每一步都需要由剪接体催化完成。

不同建库测序得到的到底是哪一步的RNA？

剪接体（Spliceosome）是一个由大量蛋白因子介导、核酸（RNA）催化的金属核酶（protein-directed metalloribozyme）。在剪接反应过程中，组成剪接体的蛋白质-核酸复合物及剪接因子按照高度精确的顺序进行结合和解聚，并伴随大规模的结构重组，组装成一系列具有不同组分和构象的统称为剪接体的分子机器，根据它们在RNA剪接过程中的生化性质，这些剪接体又被人为区分为B、Bact、B*、C、P、ILS等若干状态。

获取剪接体在激活及催化反应过程中不同状态的结构是最基础也是最富挑战性的结构生物学难题之一。

2015年8月21日，两篇文章的题目分别为“3.6埃的酵母剪接体结构（Structure of a Yeast Spliceosome at 3.6 Angstrom Resolution）”和“前体信使RNA剪接的结构基础（Structural Basis of Pre-mRNA Splicing）”在science上发表。第一篇文章报道了通过单颗粒冷冻电子显微镜（冷冻电镜）方法解析的酵母细胞剪接体近原子水平分辨率的三维结构，第二篇文章在此结构的基础上进行了详细的分析，阐述了剪接体对前体信使RNA执行剪接的基本工作机理。

2016年1月8日，Science又发表了清华大学生命学院施一公教授研究组关于剪接体的结构与机理研究长文《U4/U6.U5 三小核核糖核蛋白复合物3.8埃的结构：对剪接体组装及催化的理解》(The 3.8 A Structure of the U4/U6.U5 tri-snRNP: Insights into Spliceosome Assembly and Catalysis)，报道了酿酒酵母剪接体组装过程中的一个关键复合物U4/U6.U5 tri-snRNP高达3.8埃分辨率的冷冻电镜结构，并在此基础上分析了剪接体的组装机制，为进一步理解剪接体的激活及前体信使RNA(pre-mRNA)剪接反应的催化机制提供了重要分子基础。该结构与2015年8月报道的分辨率为3.6埃的裂殖酵母、剪接体结构的对比揭示了剪接体在pre-mRNA剪接反应过程中作为核酶(ribozyme)的催化本质。

细胞内有小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spliceosome)的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸，共分为7类，由于含U丰富，故编号为U1~U7。snRNA只存在于细胞核中，其中U3存在于核仁中，其他6种存在于非核仁区的核液里。除U6由RNA聚合酶Ⅲ转录外，其它的snRNA都是由RNA聚合酶Ⅱ催化转录的，具有修饰的碱基，并在5'末端有一个三甲基鸟苷酸(TMG)的类似"帽"结构，3'末端有自身抗体识别的Sm抗原结合的保守序列。

2016年7月22日，施一公研究组再次于Science杂志就剪接体的结构与机理研究发表两篇长文，题目分别为《酵母剪接体激活状态3.5埃的结构》（Structure of a Yeast Activated Spliceosome at 3.5 A Resolution）和《第一步催化反应后的酵母剪接体3.4埃的结构》（Structure of a Yeast Catalytic Step I Spliceosome at 3.4 A Resolution），报道了酿酒酵母剪接体激活和剪接反应催化过程中两个重要状态的剪接体复合物近原子分辨率的三维结构，阐明了剪接体的激活和催化机制，从而进一步揭示了前体信使RNA剪接反应的分子机理。
在最新发表的这两篇文章中，研究组探索并优化了蛋白提纯方案，捕获了性质良好的酿酒酵母剪接体分别处于激活状态（activated spliceosome，又称为Bact complex）和第一步催化反应后（catalytic step I spliceosome，又称为C complex）的优质样品，并利用单颗粒冷冻电镜技术和高效的数据分类方法，重构出了总体分辨率分别为3.5和3.4埃的两个高分辨率冷冻电镜结构，并搭建了原子模型。这两个复合物近原子分辨率三维结构的解析，首次完整地展示了第一步转酯反应前后pre-mRNA和起催化作用的snRNA的反应状态，以及剪接体内部蛋白组分的组装情况。尤为值得一提的是，催化核心区域的分辨率达到了2.8至3.0埃，清晰的展示出剪接反应中心的结构信息，为解释剪接体对pre-mRNA splicing的催化机制提供了迄今最为清晰的关键证据。

参考：复杂精巧的RNA剪接体 - iGEMerCPU