上传RNA-seq数据到NCBI GEO数据库

SRA - NCBI

example - NCBI

要发文章了，审稿时编辑肯定会要求你上传NGS测序数据。

一般数据都是放在集群，不可能放在个人电脑上，因为有的数据大的吓人（几个T）。

所以我们就建一个文件夹，然后把所有需要的fastq文件链接到这个文件夹就行了（copy太慢，也太占空间）。

接下来，NCBI账号申请好了，那就可以直接上传了，用aspera来上传。

参考：　

原始数据极速上传NCBI SRA教程 - 比较全面，基本照着做就好了

使用Aspera从EBI或NCBI下载基因组数据 - 补充aspera的使用方法 　

Tutorial: How to upload your data to the evil Sequence Read Archive (SRA)? - 英文版的，写的比较规范

你需要下载的是一个叫aspera connect的软件，aspera系列软件太多，别下错了。

这个奇葩的软件必须要到Linux浏览器里才能有下载链接出现，所以你得有一个Ubuntu系统。下载好了之后再传到集群上。

注意有个密钥（-i 选项）需要从ncbi上下载，最终上传页面上有。

NCBI上传数据到SRA，一切都比较顺利，只是需要你自己收集一些信息，填一些表。

这不是问题，要理解NCBI的数据管理架构！！！

但是我却遇到了一个天大的问题，直接花费了了我一晚上来解决，所以一定要耐心的看NCBi的错误提示啊。

Your table upload failed because multiple BioSamples cannot have identical attributes

就是在你填样品表时，除了一些必备列之外，其他列的信息不能完全一样！！！

所以我最终的解决方案就是，把样品名（肯定不一样）copy到某一列；或者直接在某一列填1累加的数字，防止重复。

如果你不好好看报错的话，真的是不知道这一步到底错在哪里。而且大部分老师的样品就是样品名不同，其他的信息都一样，所以看网上求助的人还是很多的，百度基本没有正确的答案。

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之前的教程有误，现在系统的更正一遍。

1. 注册NCBI账号，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

打开首页，有个大大的submit图标，注册好，然后sign in。

选择自己要submit的项目：

• GenBank：一些组装好的序列，如基因组DNA，各种RNA
• Sequence Read Archive (SRA)：所有的raw data只能上传到这里
• TSA：Submit computationally assembled, transcribed RNA sequences after submitting unassembled reads to SRA.
• GEO：Submit RNA-seq, ChIP-seq, and other types of gene expression and epigenomics datasets. 也就是我们常用的基因表达数据，这里可以上传处理后的数据，如count和TPM，FPKM等
• BioProject & BioSample：这是NCBI的核心组织架构，一篇文章就是一个BioProject，一个project里可以包含多个BioSample

推荐：在上传所有数据前，先建立BioSample条目，然后创建BioProject，将它们组织起来。【这里只是创建空的条目，后面再传raw data到SRA的时候可以链接到一起】

如下就是最终的架构：

我们再看个案例：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA558807

这里就是一篇NC上的文章，所有数据都放在一个project里，项目名字就是文章名字，介绍就是文章摘要。

Sequence data

• SRA Experiments 12

Publications

• PubMed 1
• PMC 1

Other datasets

• BioSample 12
• GEO DataSets 1

SRA数据上传操作细节：

这里不建议通过GEO上传raw data，直接去SRA数据库。

不要用ftp，除非你的网速和机器十分优秀和稳定，否则建议用aspera。【我用ftp就一直被ncbi拒绝连接】

构建好project喝sample之后，填好sra中fastq与sample的对应关系就可以开始上传了。

注意：填表的时候一个biosample最多只能有256个fastq文件，如果超过了就必须分批上传。【一个biosample可以有多行，但是library必须不同，以作区别】

~/.aspera/connect/bin/ascp -i /home/you/.aspera/connect/aspera.openssh -QT -l3m -k1 -d /home/you/project/scRNA-seq/rawData/your.dir/geo_submission_2020Mar30 your.address_from_ncbi

可以用nohup放在后台运行，　　

关于文件收集：

1. 建一个文件夹，如geo_submission_2020Mar30
2. 找到之前流程的file list文件，绝对地址不要老是变
3. 构建超链接，放入子文件夹
4. 筛选出特定的样本文件

cut -f2 all.csv -d, | xargs -I{} ln -s {} ./geo_submission_2020Mar30
cut -f3 all.csv -d, | xargs -I{} ln -s {} ./geo_submission_2020Mar30

　　

关于处理后文件的上传（基因表达谱）：

案例：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE144980

不管再大的项目，流程熟了，基本半个工作日就可以完成数据的上传，然后看网速，等全部upload了就可以一键submit。【我限速3M，大概3个小时可以传5G的数据】

NCBI的数据管理架构非常值得学习。

ftp的代码：

open ftp-private.ncbi.nlm.nih.gov
ncftp -u geoftp ftp-private.ncbi.nlm.nih.gov

cd uploads/ellylab_0zSn02Ma
lcd /home/lizhixin/project/scRNA-seq/rawData/SAG_HCO.upload.ncbi
put -R geo_submission_2020Mar30