Bisecting GlcNAc is a general suppressor of terminal modification of N-glycan （解读人：王茹凯）

文献名：Bisecting GlcNAc is a general suppressor of terminal modification of N-glycan（平分GlcNAc是N-聚糖末端修饰的一般抑制剂）

期刊名：MCP

发表时间：（2019年10月）

单位：

1. 广岛大学物质科学研究科
2. 爱尔兰国立大学糖业科学小组
3. RIKEN-Max Planck联合研究中心结构糖生物学小组

物种：小鼠大脑组织、肾组织

技术：转染、蛋白印迹、凝集素印迹、免疫荧光、定量PCR、糖基转移酶化验、LC-MS\MS、建模

一、 概述：

在这里，我们发现，等分GlcNac（n -聚糖中的一个分支糖残基）抑制各种类型的终端表位的生物合成Ñ -glycans，包括岩藻糖，唾液酸和人天然杀伤-1。在缺乏平分GlcNAc的生物合成酶GnT-III的小鼠中，这些表位在N-聚糖中的表达升高，并且相反地在细胞中被GnT-III过表达抑制。N-聚糖末端的许多糖基转移酶显示更喜欢非等分的N-聚糖作为其一分为二的对应物的底物，而未发现其mRNA、酶的上调。这表明在GnT-III缺陷型小鼠中末端N-聚糖表位的表达升高归因于生物合成酶的底物特异性。分子动力学模拟进一步证实，未等分的聚糖优先被那些糖基转移酶所接受。这些发现揭示了蛋白质N-糖基化的新调节机制。

二、 研究背景：

糖蛋白装饰有复杂的聚糖，以发挥蛋白功能。但是，复杂的聚糖生物合成的调节机制尚不清楚。本文旨在研究复杂的聚糖生物合成的调节机制。

三、实验设计：

四、研究成果：

为了确定平分GlcNAc是否影响N-聚糖其他部分的生物合成，通过液相色谱（LC）-质谱（MS）/ MS分析了Mgat3 + / +和Mgat3-/-小鼠大脑的N-聚糖结构（图1B）。我们首先发现，在Mgat3-/-脑中，具有二等分GlcNAc并被推论为二等分GlcNAc的N-聚糖消失了（图1B，蓝色表示）。Mgat3-/-脑中许多聚糖的水平增加（图1B，用红色表示），并且令人惊讶的是，这些增加的聚糖中的岩藻糖和唾液酸残基的数量高于Mgat3-/-脑中已减少的N -聚糖。在此，Mgat3-/-中多岩藻糖基化聚糖的信号强度总和要比Mgat3 + / +高得多，而Mgat3-/-脑中单岩藻糖基化聚糖的信号强度却降低到不足50％（图1C，左）。清楚地观察到Mgat3-/-中单唾液酸化和多唾液酸化聚糖的相似增加（图1C，右）。与MS结果一致，凝集素印迹表明，Mgat3-/-大脑蛋白被AAL（与岩藻糖反应）（图1D）染色更强。 Mgat3 + / +和Mgat3-/-脑之间的岩藻糖特异性PhoSL染色不变（图1D，2面板）表明，Mgat3-/-脑中Le型岩藻糖基化增强，但核心岩藻糖基化未增强。我们还观察到，在用SSA、 MAM（能富集唾液酸的糖肽）的凝集素印迹中，Mgat3-/-brain在Mgat3-/-brain中的a2,6-唾液酸化和a2,3唾液酸化分别增加（图1E，左、中间面板）。平分的GlcNAc反应性凝集素，促红细胞凝集的植物血凝素（E4-PHA）信号消失说明Mgat3-/-脑中不存在平分的GlcNAc（图1E，右图）。

总的来说，MS和凝集素印迹数据表明，Mgat3-/-的末端岩藻糖基化和唾液酸化增加，这表明平分GlcNAc对N-聚糖中这些末端结构的生物合成具有负面影响。 

接下来，我们检查了N-聚糖的其他末端修饰的水平，这些水平无法通过常规MS分析检测到，例如HNK-1和聚唾液酸（polySia）（图2A）。对成年小鼠脑进行Western印迹和免疫染色显示，Mgat3-/-脑中HNK-1表位的水平增加了（图2B，C）。对新生儿（P0）小鼠大脑和原代脑神经元（从E18胚胎分离的DIV15）进行的蛋白质印迹显示，Mgat3 + / +和Mgat3-/-小鼠之间的polySia表达水平几乎相同（图2D ）。对成年脑切片进行免疫染色也证实了成年Mgat3 + / +和Mgat3-/-小鼠之间polySia的等效表达（图2E）。

这些数据显示，Mgat3-/-脑中的HNK-1表位上调而不是polySia 

为了检查在大脑中发现的上述结果是一般的还是更具大脑特异性的，我们还通过LC-MS分析了肾脏中的N-聚糖。在肾脏中观察到的聚糖结构的数量高于在大脑中的聚糖结构。MS分析中岩藻糖基化聚糖信号强度的总和表明，Mgat3-/-中的四岩藻糖基化多糖和五岩藻糖基化的N-聚糖的数量比Mgat3 + / +中的高，而在岩藻糖基化中，二岩藻糖基化聚糖的信号强度降低在 Mgat3-/-肾脏（图3A）。

同样，Mgat3-/-肾脏中未唾液酸化的聚糖减少，而唾液酸化的聚糖增加（图3B）。

这些发现与大脑和大脑的结果一致：提示二等分GlcNAc的缺失通常会导致聚糖末端修饰的增加

岩藻糖基转移酶（Fut1-11），唾液酸基转移酶（St3gal1-6，St6gal1,2），HNK-1合成酶（B3gat1,2）和polySia合成酶（St8sia2,4）在Mgat3-/-脑中均未上调（图 4A）。Mgat3-/-小鼠中所有测试的供体底物水平均未上调（图4B）。根据产物的峰面积测量其酶活性，发现除FUT1外，所有测试的酶对平分型底物的活性均低于对非平分型底物的活性（图4C，D）。

这有力地表明，二等分GlcNAc的丧失将N-聚糖从非优选的酶底物转化为用于N-聚糖末端修饰的酶，从而导致了Mgat3-/-大脑中岩藻糖，唾液酸和HNK-1表位的更高表达水平。

细胞内的Le -岩藻糖基化酶、ST3GAL4(唾液酸转移酶)和GIcAT-P(葡糖醛酸基转移酶)活性被GnT-III过表达抑制。Hela细胞中Le型岩藻糖基化酶FUT2，FUT4和FUT9的过表达导致AAL(与L-岩藻糖特异性结合的凝集素)反应性急剧增加（图5A），FUT过表达对AAL反应性的这种作用已通过GnT-III的共表达得到了明显抑制（图5A）。CHO细胞中ST3GAL4的过表达略微增加了细胞蛋白的MAM（与唾液酸特异性结合的凝集素）反应性，而GnT-III的过表达降低了这种作用（图5B）。GnT-III过表达明显抑制了Hela细胞中HNK-1的产生（图5C）

非二等分和二等分n-聚糖与GlcAT-P和ST6GAL1的结合构象。分子建模研究发现：GlcAT-P复合物与非等分双天线N-聚糖（GGnGGnbi）显示a1,3-分支与GlcAT-P受体结合位点结合，而a1,6-分支的Gal-6'与R162形成了良好的静电相互作用，GlcAT-P转移了葡萄糖醛酸 到a1,3-分支的效率要比到a1,6-分支的效率高相比之下（图6A）。a1,6-分支对等双天线N-聚糖（bisectGGnGGnbi）在GlcAT-P复合物中的表达占据了延伸的构象，并且与GlcAT-P的相互作用消失了（图6B）。

a1，3-分支的末端Gal-6部分结合到受体位点并与W257形成堆积相互作用（图6C）。在平分GlcNAc的情况下，a1,6-分支具有反向折叠构象（补充图S8F），并且主要与壳二糖核心相互作用。Gal-6’和酶之间这种极性相互作用的丧失导致底物的识别能力差（图6D）。这些发现表明，被二等分的聚糖被GlcAT-P弱识别。

五、文章亮点：

• N-聚糖中二等分GlcNAc的丢失会增加各种末端聚糖修饰。
• 糖基转移酶通常在平分GlcNAc时对聚糖的作用不佳。
• 二等分的GlcNAc的存在会改变N-聚糖的整体构象。
• 平分GlcNAc用作末端修饰的一般抑制子。

阅读人：王茹凯