xgene：之illumina，，ion-torrent

illumina技术：

　　工具：flowcell(流动池)：8通道，每个通道都有 2种DNA引物 种在玻璃表面(用共价键连到Flowcell上)，这引物和文库中的接头互补

　　　　    Flowcell：8个line，，line：上下两个表面，，面：3个扫描通道swath，，swath：16个方块tile

　　文库制作：超声打断DNA，用酶补平，用Klenow酶加碱基，用连接酶 在双端 加特定接头，形成DNA混合物 称为DNA文库。

　　　　特点1，中间为待测序列；

　　　　特点2，两端接头序列人工加上去，已知，大有文章可做。

　　桥式PCR：把文库种到芯片上，扩增

　　　　种文库：引物接头互补，会互补杂交，完成种文库。加入dNTP和酶  沿着作为模板的文库 生成一条新DNA链，与要测的链完全互补。

　　　　　　　　加NaOH碱溶液，解链，冲走文库模板链，留下刚生成的链(因为其长在芯片上)，加中和液，弯曲 接头另一端与芯片上另一种引物互补杂交

　　　　扩增：加入dNTP和酶 ，合成出一条新链，加碱解链，加中和液中和，弯曲互补杂交，，，重复之。。

　　制备单链：通过把其中一个引物上一个特定集团切掉，加碱解链，水冲，只留一半的 某一种引物连接DNA链，

　　正式测序：加入两种东西，一是带荧光标记的dNTP，其3'端堵住了；二是聚合酶。每次只能加上一个碱基，后停止。水冲。激光扫描 推断碱基。这个推断的与要测的片段完全一致，都是与芯片上的模板互补的。

　　　　　　    一个循环后，加入化学试剂，切掉3'叠氮集团和荧光集团。。下一轮……

　　index (即barcode)：每个样本有特定的接头，每个接头里有一段特定序列——index。用于标记样本的来源。

　　　　　　　先把测完序的Read1解链掉，加入中性液，，加入Read2引物  这个引物就在index序列旁，开始第二轮测序 读取index，一般6-8bp

　　双端测序：正向读一遍，从另一个方向再读一遍。方法：先用桥式合成一个互补链，后把自己切掉，冲走，让互补链再测长度的另一半。

　　　　　　　解答：本链在芯片上，互补链是从上到下(3'-->5')方向合成 测序，，，，桥式合成互补链后，互补链的上端种在芯片上 成了下端，

　　　　　　　　　　　　　　　　  互补链从下到上(3'-->5')，那用它测序时 还是从上到下(3'-->5')，与原来方向一致 3'-->5'也不违背。只是base calling时要取互补。

　　phasing 和 prephasing：每次反应，各种原因，总有少量分子没有完成参加反应，下次反应时发的荧光就与大部队不一样，形成噪音；或遇到一个3'没有叠氮集团的碱基 一次加入了两个碱基，就超前了，又是噪音。

　　chastity 和 Pass filter：对荧光纯粹程度的描述。Chastity的定义，就是浓度最高的那个荧光素的量，除以浓度第二的荧光量，》=1.5，则为好碱基。

　　　　　　　　　　　　  对每个read的质量都要做一个叫“pass filter”的检验。看前25个碱基当中，如果只有一个、或者没有坏碱基，则Pass filter就通过；如果有超过一个以上的坏碱基，Pass filter就不能通过。

ion-torrent——Thermo Life公司

 建库过程：

建库：是在样本DNA片段的两侧加上标准接头的这样一个过程。

在加接头时，一端(连珠子)加入P1接头，同时另一端(测序起始段)加入X接头或者A接头。 其中X带barcode 故可一个芯片测多个样本文库 后由barcode分辨，A不带barcode 一芯片测一样本。

AmpliSeq是Ion Torrent平台上很好用的一个建库方案。它的核心，就是通过多重PCR的方法，一次从样本中把要测序的多个DNA片段给扩增出来，然后转化成文库进行测序。。

AmpliSeq文库通过多重PCR扩增出来的DNA，再加上接头，做的文库。

Thermo Life公司在设计 Ampliseq 的 PCR引物 的时侯，在这个引物上特别设计了一种化学修饰，这种化学修饰可以被 Fupa试剂 所切断。Fupa试剂把 PCR扩增产物 上大部分的引物序列都给切掉。测序时，就可以尽可能多地测到样本序列。

油包水PCR，成为可上机的珠子：

第二步：就是把文库种到测序珠子上去，并且进行扩增。

油包水PCR包括两个相：油相和水相。其中水相是核心，油相起到分隔作用。水相中包括文库、引物、酶、Master Mix、测序珠子，这5种PCR反应的主要成份。

测序珠子是接下来测序的核心载体。PGM上珠子直径是2.4微米；Proton直径约一微米。珠子的表面共价连接了许多PCR引物，与文库的P1接头是互补的。

游离的PCR引物，它的5’端标记了生物素。引物的序列，是和前面的A接头、或者X接头相一致的。

水混合 --> 油混合。在整个油包水PCR反应当中，文库分子和测序微珠是限量因素。几乎每个小水滴中都会有足够量的引物、酶、和dNTP。

PCR反应，一文库一珠子才可用。

珠子的纯化 富集，用带链霉亲和素的磁珠吸附，pcr扩增反应后带生物素的珠子。洗脱液洗脱测序珠子，分离磁珠。

上机测序及数据质量：

测PH值的变化，

Key sequence，测序最先的四个碱基。分别是A、C、G、T。因为每个珠子上长多少个DNA链，它的变化范围是很大的，所以用Key Sequence的A/C/G/T四个碱基所测到的 PH值变化的强度，来确定这个珠子的正常的信号强度。后面测到的信号与这四个信号强度进行比对。

影响有效数据的因素：

1. 1. ISP density：芯片上有珠子的孔占的比例。在把珠子加到芯片上的过程中决定了这个值
   2. 珠子上是否长了DNA 链。这过程由磁珠纯化过程来决定。
   3. 单克隆、多克隆珠子的比例。只有单克隆珠子才能产生有用 的数据。在油包水PCR过程中决定。符合泊松分布理想的有70-80%单克隆
   4. 珠子上是不是带的有用样本序列
      • 文库中的引物二聚体序列，无效数据
      • 低质量数据
      • 阳性对照珠子，质控的，无用数据

优缺点：

Ion Torrent平台的主要测序优势，是可以从很少量的起始DNA来进行测序。一般情况下，5~10个ng的DNA就足够进行一次质量良好的测序了。

这个优势，是基于Thermo Life公司推出了一系列基于多重PCR的建库方案。

Homopolymer问题：就是测序仪在测到一连串相同的碱基时，就读不准到底有几个碱基。

改进：推出了Hi-Q酶，这个酶的特点就是聚合反应非常快，它所产生的PH值的变化的峰，更高、更尖、更利于判读。提高准确性

油包水PCR反应是一个对操作很敏感的实验步骤。为了提高实验结果的一致性，也为了减少人工消耗，Thermo Life公司还在Ion Torrent平台上推出：

• 半自动的油包水PCR反应仪：“One Touch”，
• 全自动的油包水PCR反应仪：“Ion Chef”