项目文章｜DNA(羟)甲基化研究揭示铁离子依赖表观调控促进狼疮致病性T细胞分化｜易基因

易基因（羟）甲基化DNA免疫共沉淀测序（h）MeDIP-seq研究成果见刊《Journal of Clinical Investigation》

2022年5月2日，中南大学湘雅二医院赵明教授团队、中国医学科学院皮肤病医院陆前进教授团队合作在Journal of Clinical Investigation上发表了题为“Iron-dependent epigenetic modulation promotes pathogenic T cell differentiation in lupus”的研究成果。该研究首次揭示铁离子过载通过调节DNA去甲基化促进以滤泡辅助性T细胞（Follicular helper T cells，Tfh cells）为代表的致病性T细胞异常分化，从而加重自身免疫抗体产生及系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）发病，提示T细胞内铁离子可能是治疗SLE的新靶点。

标题：Iron-dependent epigenetic modulation promotes pathogenic T cell differentiation in lupus（铁离子依赖的表观遗传调控促进了狼疮致病性T细胞分化）

期刊：Journal of Clinical Investigation

影响因子: IF 14.808

发表时间：2022.05.02

技术平台：RNA-seq、MeDIP-seq、hMeMIP-seq、hMeMIP-qPCR（易基因提供）

摘要：

微量元素铁水平会影响免疫反应和疫苗接种，但铁离子在自身免疫性疾病中的作用尚不清楚。致病性T细胞，尤其是滤泡辅助性T细胞（Tfh）的异常扩增在系统性红斑狼疮（SLE）的发病机制中起着重要的作用。本研究作者揭示了铁在SLE致病性T细胞分化调控中的重要作用。铁过载促进了狼疮易感小鼠Tfh细胞扩增、促炎细胞因子分泌和自身抗体的产生。经高铁饮食（high-iron diet,HID）处理的小鼠表现Tfh 细胞百分比增加和抗原特异性 GC 反应。补充铁有助于Tfh 细胞分化，而铁螯合则抑制Tfh细胞分化。研究结果证明miR-21/BDH2通路在Tfh细胞分化过程中促进铁蓄积，并进一步促进Fe2+依赖性TET酶活性和BCL6基因去甲基化。因此，维持铁稳态可能对消除致病性 Th 细胞至关重要，并可能有助于改善 SLE 患者的管理。

铁过载对SLE致病性T细胞分化和发病机制的作用示意图

背景：

系统性红斑狼疮（SLE）是一种复杂的自身免疫性疾病，致病性T细胞的异常扩增在系统性红斑狼疮的发病中起到重要作用。特别是滤泡辅助性T细胞（Tfh cells）辅助B细胞活化分化为浆细胞，产生大量自身抗体。SLE患者体内T细胞异常活化分化的机制仍未阐明。铁是体内一种重要的微量元素，参与包括DNA复制、ROS产生等许多生物学过程。铁离子水平也会影响免疫反应和疫苗接种，但铁离子在自身免疫性疾病中的作用尚不清楚。目前暂无相关研究报道铁离子在Tfh细胞的分化中的调控作用。

方法：

患者招募

从门诊皮肤科诊所和住院病房招募193名SLE患者，根据狼疮活动指数(SLEDAI)评分评估活动类别：无效（SLEDAI≤ 4），活跃（SLEDAI>4）。

Pristane诱导狼疮小鼠模型的建立

为诱导狼疮样疾病，给12周龄雌性WT和miR-21 cKO小鼠腹腔注射500μL的Pristane（Sigma）。在Pristane刺激观察期间每周检测尿蛋白。处理3个月后处死小鼠用于分析。从DLN和脾脏分离细胞、收集血清、将肾组织用福尔马林固定并包埋在石蜡中。

RNA-seq

从WT和miR-21 cKO小鼠中分离脾原始CD4+T细胞，在Tfh极化条件下培养5天。从Tfh细胞中提取总RNA进行RNA-seq测序。

MeDIP-seq和hMeDIP-seq测序分析

从诱导的Tfh细胞中分离DNA,1µg起始基因组DNA片段平均大小为300bp。在深圳市易基因科技有限公司进行DNA甲基化免疫共沉淀测序（MeDIP-seq）和DNA羟甲基化免疫共沉淀测序（hMeDIP-seq）分析。

结果：

该研究首次揭示铁离子过载通过调节DNA去甲基化促进以Tfh细胞为代表的致病性T细胞异常分化，从而加重自身免疫抗体产生及SLE发病，提示T细胞内铁离子可能是治疗SLE的新靶点。研究人员首先发现SLE患者CD4+T细胞中的Fe2+水平显著升高，与Tfh细胞的百分比呈正相关。进一步通过高铁饮食实验证明提高铁离子水平有利于小鼠体内Tfh细胞和GCB细胞扩增，增加CD4+T细胞炎症因子IFN-γ和IL-17A分泌，促进MRL/lpr狼疮小鼠体内自身抗体产生，加重狼疮小鼠疾病表型。补充铁离子可以促进Tfh细胞体外诱导分化。相反，用2,5-二羟基苯甲酸和铁螯合剂CPX可以减少细胞内的铁离子蓄积，显著抑制Tfh细胞分化。机制方面，研究揭示miR-21/BDH2通路在调控T细胞内铁离子蓄积以及Tfh细胞分化中发挥重要作用。过表达miR-21或干扰BDH2表达，可以增强TET蛋白酶活性，导致Tfh细胞分化关键转录因子BCL6基因启动子低甲基化，促进BCL6基因表达。

关键图形：

作者通过甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）和羟甲基化DNA免疫沉淀-qPCR（hMeDIP-qPCR）来鉴定miR-21/BDH2对Tfh基因DNA甲基化/羟甲基化的影响。在Agomir-21或siRNA-BDH2细胞转染中，显示BCL6基因启动子区域DNA羟甲基化水平增加和DNA甲基化水平减少，但与相应对照组相比，CXCR5、PDCD1、IL21启动子区域未检测到显著差异。相反，通过Antagomir-21抑制miR-21表达或通过pCMV6-BDH2过表达BDH2降低了TET酶活性。BCL6基因启动子中抑制miR-21或过表达BDH2的细胞表现出DNA羟甲基化水平减少和DNA甲基化水平增加。此外，PDCD1基因启动子区域抑制miR-21细胞的DNA甲基化水平也增加。然而，CXCR5和IL21基因启动子的DNA甲基化/羟甲基化没有明显差异。

图：miR-21/BDH2通路通过调节细胞内铁离子促进BCL6基因的DNA羟甲基化

在用Agomir-21或siRNA-BDH2转染的Tfh细胞中使用MeDIP-Seq和hMeDIP-Seq验证了BCL6启动子区域的5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）分布变化。

图：BCL6基因的5mC MeDIP-seq和5hmC hMeDIPseq的代表性IGV分析

结论：

本研究表明，铁离子过载是狼疮自身免疫反应的重要诱导因素，并表明调节铁稳态可能是SLE治疗的良好靶点。本研究还为控制膳食铁在SLE患者临床管理中的重要性提供了实验依据，为SLE治疗提供了新潜在策略。

易基因小结：

该研究揭示了miR-21/BDH2/Fe2+调控SLE中Tfh细胞异常分化的新机制，扩展了对铁在自身免疫性疾病和体液免疫中作用的认识。本研究对于患有缺铁性贫血的SLE患者临床补铁治疗也具有一定的指导意义。提示临床上缺铁性贫血的SLE患者补铁时要注意监测炎症因子与自身免疫抗体滴度的变化，当贫血症状显著改善或者炎症因子水平与自身抗体滴度显著升高时，应当及时调整补铁剂量。

关于DNA羟甲基化

羟甲基化5hmC是哺乳动物基因组上的第六碱基，在发育、衰老、神经退行性疾病、复杂疾病及肿瘤发生过程中起重要作用。DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化标准的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。

传统BS转化无法区分5mC和5hmC

传统的Bisulfite测序中，5hmC经过Bisulfite处理后变为CMS，CMS在测序中仍然被读作C碱基，因此不能区分5mC和5hmC。

化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。

目前羟甲基化测序技术满足多种应用需求：

• 全基因组氧化甲基化测序（oxWGBS）
• 简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS）
• 目标区域靶基因氧化甲基化测序（Target-oxBS）
• 羟甲基化DNA免疫沉淀测序（hMeDIP-seq）

专注表观组学十余年，欢迎一起交流讨论～

http://www.egenetech.com/

参考文献：DOI:10.1172/JCI152345

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