xgene：WGS，突变与癌，RNA-seq，WES

人类全基因组测序06

SNP(single nucleotide polymorphism)：有了10倍以上的覆盖深度以后，来确认SNP信息，就相当可靠了。

一个普通黄种人的基因组，与hg19这个参考基因组序列相比，会有350万个左右的SNP。又有大概2万个是落在外显子上的，而非同义的SNP有大概9千个。

所谓非同义的SNP，就是这些SNP是会引起蛋白质的序列变化的。

　　indel：(insertion & deletion)是指小于50个bp以内的微小的插入、和缺失突变。一个普通黄种人的基因组和hg19相比，约有50万个Indel。其中落在外显子上的，大概在1千个左右。

　　　　那么Indel如果一旦落在外显子区域，它一定会引起蛋白质序列变化的。

　　　　　　如果它引起的是移码突变，那么在移码位点之后，所有氨基酸序列就和原来的序列完全不同。

　　　　　　如果它（基因）还能保持原来的阅读框，也会引起蛋白质中若干个氨基酸的增或者减。

　　SV： structure variation 染色体结构变异

　　　　 1、染色体内部的位移

2、染色体之间的位移

3、大片段的缺失

4、大片段的插入

5、大片倍的加倍

6、大片段的倒位

　　CNV ：copy number variation 拷贝数变异，是指染色体片段的拷贝数变异：包括拷贝数增加，也包括拷贝数减少。

　　　　实际上，CNV是和结构变异（也就是SV）紧密相关的。SV 中的大片段的增加、和大片段的缺失，会直接导致CNV的变化。

突变种类与癌症04

基因拷贝数异常：

　　例如：HER2基因，如果HER2基因的拷贝数增加到6个，或者更多，它就比较容易引发乳腺癌。

　　赫赛汀（Herceptin）这个药，可以抑制HER2蛋白的活性，所以赫赛洒就对于由HER2基因拷贝数异常增加引发的乳腺癌，有非常好的治疗作用。

染色体结构变异：

　　强启动子替换了弱启动子，改变了某个基因在天然条件下的表达量。

　　例如：EML4-ALK的融合基因。ALK是一个推动细胞生长、增殖的这样一个基因。在野生型的条件下，它的表达量是比较低的。还有一个基因叫EML4基因，这个基因有一个强启动子。

　　有一个药物，叫克里唑替尼（crizotinib）。这个药对EML4-ALK融合基因导致的肺癌有非常良好的疗效。

基因的点突变：

　　例如：BRAF基因的V600E突变。BRAF本身是个激酶，是打开下游细胞增殖通道的一个开关。当BRAF的第600个氨基酸，从缬氨酸被突变到了谷氨酸之后，它的酶活性就被持续地活化，它就持续地打开下游促进细胞分裂的这个信号通路。

　　维罗非尼（vemurafenib）这个药物正好能够抑制BRAF的这个激酶的活性，所以它能够有效治疗有BRAF V600E突变的肿瘤。

抑癌基因突变成无效基因

　　突变在大多数情况下，是使一个基因失去活性。只有在少数情况下，会增强一个基因的活性。

　　例如：TP53这个基因的最重要的一个功能，是在细胞受到伤害之后，TP53会引导细胞进行凋亡。

　　如果一旦TP53发生了突变，失去了功能，或者这个细胞彻底就把TP53这个基因搞丢了之后，细胞就不容易进入凋亡。当它不容易进入凋亡呢，它也就有更大可能性变成肿瘤。已经在很多的科学实验中发现，大概在50%的肿瘤里面，有TP53基因突变的情况存在。

RNA -seq：07

RNA-seq目的、用处：：可以帮助我们了解，各种比较条件下，所有基因的表达情况的差异。

比如：正常组织和肿瘤组织的之间的差异；检测药物治疗前后，基因表达的差异；检测发育过程中，不同的发育阶段，不同的组织之间的基因表达差异等

在所有检测的差异类型中，最常用的一种检测就是：检测所有mRNA的表达量的差异。

还可以检测 RNA 的结构上的差异。例如：mRNA的剪接方式的差异，即“可变剪接”；还可以检测“融合基因”，同时还可以检测基因单点突变导致的SNP。

测序方法、步骤：人的细胞或组织，一般抽提到的总RNA当中，95%都是核糖体RNA。剩下的2%到3%是mRNA。还有2%到3%是Long non-coding RNA、或者tRNA、microRNA等

先把核糖体RNA先去掉。然后再进行建库测序。比如利用Poly(A)尾巴抓出mRNA ，镁离子溶液打断，逆转录成cDNA ，再建库扩增，测序

表达量指标：目前最常用的是RPKM值，对基因表达量进行相对定量的一个指标。RPKM是 Reads Per Kilobase of exon model perMillion mapped reads。

除以这个外显子的长度，它的目的：是修正这个mRNA长度所引起的mRNA的Read数的偏差。

火山图：针对全转录组的分析，表达的是一次看到一个整体的样本（表达）差异的情况。

横轴表示某个基因的表达量是上升或下降。纵轴是表示这种差异的置信程度。这其中的每个点，就是两个样本当中同一个基因的mRNA表达量的变化。

聚类分析图：它是通过多个样本的全基因表达谱对比，来找到它们之间的相似性，和相近关系。

一张聚类分析的图，横轴是样本，纵轴是基因。

应用：我们可以分析疾病的亚型；还可以通过对多个基因在特定疾病当中的表达倾向性，来找出可能的、新的、诊断用的Biomark。

GO(gene ontology)分析：

GO主要描述基因的三个属性：

第一，是这个基因，它参与的生物过程

第二，是这个基因产物的功能

第三、是这个基因产物在细胞器内的空间定位

差异基因GO富集柱状图：可以直观的反映出在生物过程、细胞组分、和分子功能富集的差异基因的个数分布情况。柱子越高，则表示这个亚类当中突变越多。

有向无环图，是差异基因GO富集分析的图形化展示方式，从上到下，它所定义的功能范围越来越小、越来越精准。它的分支，表示包含关系。而这个圈圈的颜色越深呐，表示这个富集关系程度越高。

通路(Pathway)分析：在系统水平上完成生物的某一功能的基本单元、或者局部子网络。

散点图是KEGG富集分析结果的图形化展示方式。

在图中，KEGG富集程度通 Rich factor、Qvalue 和富集到此通路上的基因个数来衡量。

富集因子越大，则表示富集的程度越大。 qValue是校正之后的pValue，它越接近于0表示富集程度越显著。点面积越大呐，则富集的基因数越多。

RNA-seq中，可以测到mRNA上的各种结构上的变异，即RNA序列的变异。要求测序深度要更深。因为这样才能得到较完整的覆盖，更有把握判断新的剪接点、一个断点、哪儿碱基发生了突变等。

结构变异分析：

可变剪接：一般一个人的组织样本当中，可以通过高通量测序，发现有5000个到20000个左右的可变剪接。

基因融合：融合基因的示意图，圆形圆内弧线连接图

点突变(SNP)：泡泡图，泡泡越大突变频率越高，由大到小逆时针排列

外显子组测序08

外显子测序的核心技术，是这些针对人外显子序列设计的捕获探针库；这些探针的序列，都和人外显子的DNA序列相互补。

实验原理、步骤：

超声打碎，建成文库；

杂交，探针上有生物素；

用磁珠(其上有链霉亲和素与生物素结合)混合；

磁铁吸附磁珠，去上清液，把DNA文库从磁珠上洗脱

PCR，HiSeq测序

数据分析：比对到人的基因组上；把比对到基因组的序列进行 突变分析

一般用Agilent SureSelect 50M的试剂盒进行外显子建库、捕获。再用HiSeq 2500 V4 PE125的方法进行测序，测10个G的数据量。

在外显子测序中，要扣掉4种因素引起的无效数据：

第一个是因为杂交捕获的过程它不是十分精确的。基因组中有许多序列有一定的同源性的。这些片段，在杂交过程当中，也会被杂交捕获下来，但不是基因的外显子。

第二个，是捕获下来的一个片段，很可能它只有一部分的序列是落在目标区域，还有一部分序列是突出在目标范围之外的。这个落在目标区的数据，占全部被测到的数据的比例，即“捕获效率”(capture efficiency)。那么AgilentSureSelect这个试剂盒呐，它的捕获效率，大约是65~70%。

第三个影响有效数据比例的因素，是Duplication。用Agilent SureSelect试剂盒进行建库、捕获，实测10个G的数据，发现duplication大约在5%左右。

第四个，是目前主流的测序方法是HiSeq V4 PE125这种方法。也就是：双端各测125个碱基，那么Agilent的建库方法中当呐

WES在肿瘤测序中的优势：

外显子测序，可测Germline突变（胚胎形成时就带有的突变），也可测体细胞突变（Somatic Mutation）

因为肿瘤中的突变呐，往往都是 low allele frequency（低等位基因频率）的体细胞突变。所以，外显子组测序“深度测序”，显出比较明显的优势来。

测肿瘤中的体细胞突变，一般是拿手术切下来的肿瘤组织DNA、和病人外周血中的白细胞基因组DNA，进行外显子测序。
一般肿瘤的测100~200X的深度，白细胞的（DNA）测100X的深度。
从白细胞DNA得到这个病人的Germline基因组序列，拿肿瘤的DNA序列与之做对比，找出其中的体细胞突变。

外显子组测序，主要能够得到的信息是点突变和插入缺失突变，也就是SNP、Indel信息。

找到突变之后，就可以进一步地做GO和Pathway分析。

外显子测序对基因组的结构，变异--SV（Structure Variation），是不敏感的。因为外显子测序，只测了基因组上1~2%的很小一部分区域，当 SV 的断点不落在外显子区域的时侯，外显子测序是看不到这些断点的
外显子测序对拷贝数变异（CNV，copy numbervariation），不是很敏感。不敏感的原因呐，是因为杂交捕获过程啊，是一个含了很高偶然性的过程。
往往是这样做的：用全基因测序来找到肿瘤样本中的结构，变异（SV）和拷贝数变异（CNV），再用来外显子组测序来找肿瘤样本中的、低频的SNP和Indel体细胞突变。

Panel，往往是指针对若干个基因设计一个捕获试剂盒。诊断公司为诊断特定的疾病，设计了许多特定的、针对性的Panel。

这一类的Panel，它的建库、捕获、和测序原理，与外显子组测序是完全一样的。