GPB重磅！浙大李兰娟院士团队修饰多组学研究揭示炎症反应新机制

炎症 (inflammation) 是机体对致炎因子的损伤所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。翻译后修饰（PTMs）在调节多种炎症信号通路中起着重要作用，如磷酸化（phosphorylation，P）、泛素化（ubiquitination，Ub）和乙酰化（acetylation，Ac）已报道对病原体识别受体（PRR）依赖性炎症反应有多种影响。已有许多研究探讨了PTMs在先天免疫中的作用，但对其中PTM的动态变化，尤其是不同PTM间的Crosstalk却依然知之甚少。

近日，浙江大学附属第一医院传染病科李兰娟院士团队在国际专业学术期刊Genomics, Proteomics & Bioinformatics上发表题为 “Integrative

Proteomic Analysis of Posttranslational Modification in the Inflammatory Response” 最新成果。该研究运用蛋白质组、磷酸化修饰组、乙酰化修饰组、泛素化修饰组技术，对人和小鼠巨噬细胞的炎症反应中的PTM变化进行全面分析。研究揭示了翻译后修饰在炎症反应中的关键作用，首次系统分析了先天性免疫应答过程中PTM间的Crosstalk，建立了一个炎症相关蛋白及其翻译后修饰的综合动态网络。

1LPS刺激巨噬细胞的整合蛋白质组学分析

为了建立一个炎症相关蛋白的综合动态网络，研究人员选取小鼠原始巨噬细胞（Raw）和人Thp1来源的巨噬细胞，建立脂多糖（LPS）诱导的炎症反应模型。运用基于同位素标记（SILAC）技术的蛋白质修饰组学技术（质谱策略），对LPS刺激后30min和2h后（样本策略，每个实验3次重复）3种PTM（乙酰化、磷酸化、泛素化）的差异变化进行精确定量。

图1、LPS刺激巨噬细胞的综合蛋白质组学分析

研究在小鼠原始细胞中鉴定到6333个蛋白质，2450个乙酰化位点（发生在1284个蛋白上）、17034个磷酸化位点（发生在4955个蛋白上）、7836个泛素化位点（发生在2898个蛋白质上）。在人Thp1来源的巨噬细胞中鉴定到6431个蛋白质，2183个乙酰化位点（发生在1089个蛋白上）、18018个磷酸化位点（发生在5162个蛋白上）、7326个泛素化位点（发生在2735个蛋白质上）。Pearson相关系数分别为0.96和0.88，表明了实验结果的高可信度和可靠的重复性。

图2、整合蛋白质组学数据具有很高的可信度

2 炎症反应中三种修饰类型的动态变化

研究揭示了炎症反应中PTM随时间的动态变化。研究人员把发生2倍以上变化（上升或下降）的PTM位点称为调控位点，将这部分显著变化的PTM位点分为六类，其中根据上升或下降差异表达分为上调组和下调组。0.5小时内发生变化的PTM位点为快变组，0.5小时后发生变化为慢变组。快变组中根据变化在2小时内的持续性，进一步分为持续组和短暂组（图3C）。研究发现，随着LPS刺激时间的延长，上调位点的比例增加，下调位点的比例减少。不同细胞的PTM性质略有不同，人和小鼠的巨噬细胞炎症反应中修饰调控的反应速度不同，小鼠Raw细胞中PTM的快变组比例更高，即反应更快（图3D）。
密度梯度图显示PTM变化的总体分布，41%差异变化的PTM位点是同步的（蛋白质与其上位点改变趋势相同），59%是异时的（蛋白质与其上位点改变趋势相反）。在两种细胞系的所有类型的PTM中，PTM上调的位点比下调的位点多，且Ac、Ub、P位点表达量与WCP表达量间存在明显差异，表明LPS诱导的信号转导对蛋白质水平的依赖性较小，PTM在炎症反应中发挥重要调控作用（图3F）。

图3、不同类型PTM修饰组的动态变化

3 免疫反应中PTM间的Crosstalk

研究发现，大量的蛋白质含有至少一种类型的调节PTM，大多数蛋白与其他蛋白有一定程度的相互作用，表明不同蛋白质的PTMs间Crosstal普遍存在（图4A）。蛋白质中总PTM位点数量与相互作用蛋白的数量成正比，其数量从大到小依次为异时蛋白、同步蛋白、单调节蛋白和非调节蛋白（图4C）。总的来说，在一个蛋白质中，串扰事件通常发生在邻近的PTM位点之间，含有异时调控PTM位点的蛋白质更可能发生串扰。发生Crosstalk的PTM位点往往位于蛋白质的不同结构域，具有更远的序列距离。
免疫反应中PTM在同一蛋白上的Crosstalk同样呈现在时间维度上的倾向性。快变组和慢变组的PTM间分析表明，“快”和“慢”型磷酸化位点的蛋白质重合度高，大多数“快”型乙酰化位点更可能与“慢”型磷酸化位点和乙酰化位点共存，而大多数“快”型泛素化位点与“慢”型磷酸化位点和泛素化位点分组（图4D）。例如在TLR4途径中，Map2k4、Map3k20、Nfkb2、Tab3和NFKBIE等蛋白质同时含有“快”磷酸化位点和“慢”磷酸化位点。此外，Mapk6同时具有“快速”泛素化位点和“缓慢”泛素化位点，而TAB2同时具有“快速”磷酸化位点和“缓慢”泛素化位点（图4E）。

图4、免疫反应中蛋白中与蛋白间PTM的Crosstalk

4炎症反应相关新蛋白和PTM

研究人员进一步整合蛋白组、乙酰化组、磷酸化组和泛素组数据，构建了MAPK和NFKB信号通路中的PTM调控网络，并阐明了LPS激活的主要炎症信号通路中的PTM机制（图5A）。受调控的PTM位点广泛存在于与原始和Thp1细胞炎症相关的几个蛋白家族（CASPASE家族、MAPK家族、MAP2K家族、MAP3K家族、干扰素相关家族、TRAF家族和RIPK家族）（图5B）。研究还鉴定到95个PTM位点发生差异变化但未报道过炎症相关的新蛋白，并使用相应的siRNA做了进一步筛选，证明炎症反应是通过减少细胞系中PTMs显著改变的蛋白质而受到影响的。

图5、TLR4信号通路中参与炎症反应的新PTM

小结:PTM在调节多种炎症信号通路中起着重要作用，该研究通过建立LPS诱导的炎症反应模型，系统描绘了先天性免疫应答过程中的磷酸化、乙酰化、泛素化修饰的动态变化，首次报道了免疫应答过程中PTM间的串扰。结果鉴定到炎症相关新蛋白，并在已知的炎症相关蛋白中发现PTM位点，有助于揭示炎症反应的分子机制。

值得一提的是，最近研究发现，乳酸化、琥珀酰化、丙二酰化等新型酰化修饰与巨噬细胞验证信号密切相关。这也提示我们，除了该研究中磷酸化、乙酰化等最常见的几种PTM外，其他PTM在炎症反应中是如何发挥调控作用？以及相互之间存在怎样的Crosstalk？该研究表明了翻译后修饰在炎症中的重要调控作用，也为进一步研究铺平了道路。

参考文献：Feiyang Ji, et al., 2021, Integrative Proteomic Analysis of Posttranslational Modification in the Inflammatory Response. Genomics, Proteomics & Bioinformatics.