NGS检测SNP

1，Fastq数据质控

2,Fastq转化成bam，包含头文件

bwa aln ref.fa test_1.fq > test_1.sai
bwa aln ref.fa test_2.fq > test_2.sai
bwa sampe ref.fa -r "@RG\tID:<ID>\tLB:<LIBRARY_NAME>\tSM:<SAMPLE_NAME>\tPL:ILLUMINA" test_1.sai test_2.sai test_1.fq test_2.fq > test.sam

3,sam 转化成bam，如果SAM文件中有header @SQ lines。

samtools view -b -S test.sam > test.bam
##如果没有header时： samtools faidx ref.fa   
##                 samtools view -bt ref.fa.fai test.sam > test.bam

4,sort bam

samtools sort test.bam > test.sorted.bam

或者：

java -jar picard.jar SortSam I=test.bam O=test.sorted.bam SORT_ORDER=coordinate

5, 标记重复

java -jar picard.jar MarkDuplicate ....

6, index 一下

samtools index test.sorted.repeatmark.bam 

7,Base Quality Score Recalibration

....

8, 使用GATK检测SNP

java -jar GenomeAnalysisTK.jar glm SNP -R ref.fa -T UnifiedGenotyper -I test.sorted.repeatmark.bam -o test.raw.vcf

使用samtools和bcftools检测SNP

samtools faidx ref.fa
samtools mpileup -d 1000 -DSugf test.sorted.repeatmark.bam > test.raw.vcf    ##（samtools mpileup -vf 。。。）

bcftools view -Nvcg -d 1000 test.raw.vcf > test.snp.vcf                     ##(我的软件运行这步会出错,用下面两行代码代替)
bcftools call -mv test.raw.vcf > test.raw_varient.vcf
bcftools filter -s LowQual -e '%QUAL<20 || DP>100' test.raw_varient.vcf > test.filt_varient.vcf

##也有直接用perl 脚本实现。在使用bcftools 得到variant calling变异后的结果后。需要对结果再次进行过滤，主要依据对比结果中的第8列消息，其中的DP4最为重要，对应的提供了四列：1, 比对结果和正链一致的reads数；2, 比对结果和负链一致的reads数；3, 比对结果在正链的variant 上的reads数；4, 比对结果在负链的variant上的reads数。当设定（value3+value4）大于某一阈值，才算是variant。

bcftools检测生成的vcf格式有10列。1，参考序列名。2，variant所在的left-most位置。3，variant的ID，（默认未设置，用“.”表示）。4，参考序列的allele。5，variant的allele（有多个alleles，则用“，”分隔）。6,variant/reference Quality。7，FILTers applied。8，varient的信息，使用分号隔开。9，Format of the genotype fields， seperated by colon （optional）。10，Sample genotypes and per-sample information（optional）。

bcftools 的第8列中显示了对variants的信息描述，其中Tag的描述如下：

Tad　　Format　　Description

AF1　　double　　Max-likelihood estimate of the site allele Frequency （AF）of the first ALT allele

DP　　　int　　　　Raw read depth (without quality filtering)

DP4　　int[4]　　　　high-quality reference forward base, ref reverse, alternate for and alt rev bases

FQ　　int　　　　　consensus quality. Positive: sample genotypes different; negative: otherwise

MQ	int	Root-Mean-Square mapping quality of covering reads
PC2	int[2]	Phred probability of AF in group1 samples being larger (,smaller) than in group2
PCHI2	double	Posterior weighted chi^2 P-value between group1 and group2 samples
PV4	double[4]	P-value for strand bias, baseQ bias, mapQ bias and tail distance bias
QCHI2	int	Phred-scaled PCHI2
RP	int	# permutations yielding a smaller PCHI2
CLR	int	Phred log ratio of genotype likelihoods with and without the trio/pair constraint
UGT	string	Most probable genotype configuration without the trio constraint
CGT	string	Most probable configuration with the trio constraint

使用bcftools过滤掉不可靠的位点：

bcftools filter的参数：

-e -exclude 主要用于表达式方式去除匹配上的位点，这个参数很关键，过滤需要此表达式

-g -SnpGap 过滤INDEL附近的snp位点，比如-SnpGap 5 则过滤INDEL附近5个碱基距离内的SNP

-G -IndelGap 过滤INDEL附近的INDEL位点

-o -output 输出文件的名称

-O -output-type 输出的格式，一般z和v都行

-s -soft-filter 将过滤掉的位点用字符串注释

-S -set-GTs setgenotypes of failed samples to missing value (.) or reference allele (0) （将不符合要求的个体基因改为"."）

eg:过滤QUAL小于10，DP值小于5，INDEL附近的位点

bcftools filter -O v  -o test.filter_variant.vcf -s LOWQUAL -e 'QUAL<10 || FMT/DP < 5' --SnpGap 5 --set-GTs .  test.vcf.gz

提取过滤后的SNP位点

bcftools view -v snps test.filter_variance.vcf > test.snp_filter.vcf

或者在vcf文件中的INFO列里，如果是INDEL的话，会标注出INDEL，因此提取SNP也可以：

grep -v 'INDEL'  test.filter_variance.vcf > test.snp_filter.vcf

注意：

|| 与 | 区别：都表示“或”运算， 但是 || 运算符第一个表达式成立的话，后面的表达式不运算，直接返回。而 |  对所有表达式都判断。 && 与 & 的区别同理

参考：https://www.cnblogs.com/xiaofeiIDO/p/6857745.html

　　　http://www.bioinfo-scrounger.com/archives/248