Reference-TMB

Paper Name：Targeted Next Generation Sequencing Identifies Markers of Response to PD-1 Blockade

Adress：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3435480/

高TMB的肿瘤样本可能含有更多的新抗原，从而成为活化免疫细胞的靶标。

　Prepare：

一、HIPAA：Health Insurance Portability and Accountability Act/1996 尚没有确切的正式中文名称，国内文献一般直接称为HIPAA法案，有的称为健康保险携带和责任法案,其目的是(化管理，以降低日益增长的医疗费用开支,起源于1991年。

二、Institutional Review Board approval(IRB-approved)：行业审查委员会批准，比如一些人体试验需要医学伦理委员会的批准。

三、anti-PD-1和anti-PD-L1：

　　nivolumab：2015年6月22日，美国FDA同意审评百时美施贵宝PD-1抑制剂OPDIVO(nivolumab)纳武单抗作为一款治疗药物用于先前有过治疗的晚期鳞状非小细胞肺癌(NSCLC) 患者

　　pembrolizumab：派姆单抗，美国默沙东公司研制，通过抑制细胞通路PD-1和PD-L1，帮助人体免疫系统对抗癌细胞。

　　anti–PD-L1 (atezolizumab)：罗氏阿特朱单抗，2016年5月19日FDA提前四个月批准了罗氏旗下基因泰克的PD-L1抗体atezolizumab（商品名Tecentriq），作为二线药物用于治疗一种叫做urothelialcarcinoma的最常见晚期膀胱癌。使得当时的PD-1、PD-L1药物市场上三足鼎立。

四、progression-free survival(PFS) and overall survival(OS)：无进展生存期
　　One type of measurement that can be used in a clinical study or trial to help determine whether a new treatment is effective. It refers to the probability that a patient will remain alive, without the disease getting worse.

五、实体瘤的疗效评价标准（RECIST )

Methods：

Patients：32个responders和33个nonresponders

NGS：

　　32个initial cohort 236个癌症相关基因的exons和19个基因的introns

　　33个independent cohort 315个基因的exons和28个基因的introns

　　Tatal Mutational Burden：

　　　　计算编码区突变，排除非编码区的突变; cosmic中的位点和肿瘤抑制基因上的truncations不计算（防止mutation load 上调：这些基因在癌症中反复突变）

　　　　使用dbSNP和ExAC数据库和SGZ（Somatic germline zygosity）算法过滤Germline突变（也就是作者使用SGZ预测出来的Somatic突变，也需要过滤dbSNP和ExAC），SGZ算法通过使用超过60000个医学样本库减少call出germline突变的可能性

　　　　Total mutation number除以coding region(236gene：0.91MB和315gene：1.25MB)获得突变负荷

　　

Results：

1、突变负荷和anti-PD-1/PD-L1反应的关系

　　在initial cohort（Fig1A）和validation cohort（Fig1B）中均观察到anti-PD-1/PD-L1 responders组突变负荷明显高于nonresponders组

A,B这种beeswarm图，参考我的博客R中的蜂蜜图画法，从生存曲线上来看，突变负荷高的组，生存期还要长些，也许正是药物的作用

突变负荷越高，个体反应率越高，同时作者也发现皮肤型黑色素瘤和非皮肤型

黑色素瘤同样存在这样的现象，皮肤型突变负荷高，个体反应率明显，见下图：

Figure S2: (A) Mutational load in tumors with cutaneous/unknown primaries in responders vs. non-responders.

(B) Mutational load in tumors with non-cutaneous primaries (acral, mucosal, uveal) in responders vs. non-responders. (C) Gene amplifications and deletions in responders vs. non-responders.

2、突变类型和anti-PD-1/PD-L1反应的关系：

　　作者发现Responder组合Nonresponder组的基因组突变数量和突变类型不同，Responder组明显高于Nonresponder组，并且发现“triple WT” group突变负荷非常的低（个人感觉说明了BRAF，NRAS，NF1是造成突变负荷偏高的主要原因）

3.那么这236-315个基因的小panel，突变负荷能否代表WES的突变负荷呢？突变负荷的高低与那些未接受anti-PD-1/PD-L1治疗但是恢复不错的患者有没有关系呢？

　　作者从TCGA搞出来了345个WES数据，发现这些gene上的总的突变数量与总的exon突变数量强烈线性相关，尤其是那些高突变负荷的样本：

　　在这些未经过anti-PD-1/PD-L1治疗但是恢复不错的TCGA样本患者中，并未发现突变负荷最高，反而处于作者文章中定义的突变负荷Intermediate范围。

4.发生在癌症相关基因上的突变和anti-PD-1/PD-L1反应的关系： 

　　NF1突变更容易出现在responders组内

　　‘triple WT’(BRAF, NRAS, NF1 wild-type.)更容易出现在noresponders组内

5.LRP1B突变和总突变负荷

　　LRP1B是肿瘤抑制基因，长1.9MB，含有一个区域与基因组不稳定性相关，该基因突变也许与总的突变负荷和anti-PD-1/PD-L1反应有关，作者发现responders组内11个患者含有LRP1B突变，而nonresponders组只有1个患者含有LRP1B突变

　　并且统计了VUS(variants of unknown significance)数目，responders组内平均含2.8mutations/VUS，nonresponders组只含有平均0.9个

　　在TCGA样本中，含有LRP1B突变的样本含有的突变总数明显高于未含有LRP1B突变的样本含有的突变总数，样本总的突变数目与含有的LRP1B数目相关

　　以上证据表明即使单个基因突变，也可能造成整个基因组范围内的突变负荷升高，甚至与anti-PD1/PD-L1反应相关：

　　

　　

Figure S3: (A) LRP1B mutations/variants of unknown significance in responders vs. non-responders.

(B) Total number of mutations among melanomas with and without LRP1B mutations.

(C) Association between number of LRP1B mutations and total mutations in the melanoma TCGA (The Cancer Genome Atlas).

5.TCR(T-cell receptor) clonality和临床效果或者肿瘤突变负荷无关：

　　

Figure S4: (A) T cell receptor (TCR) clonality in responders vs. non-responders. (B) T cell fraction in responders vs. non-responders.

(C) TCR clonality in responders vs. non-responders in “ideal” samples, defined as those obtained within 4 months of anti-PD-1/PD-L1 treatment without other prior therapies.

(D) T cell fraction in these “ideal” samples.

Figure S5: Mutation load correlated with (A) T cell receptor (TCR) clonality and (B) T cell fraction.

Discussion：

　　high (>23.1 mutations/MB), intermediate (3.3–23.1 mutations/MB), and low (<3.3 mutations/MB)mutation可以为临床上指导晚期黑色素瘤患者用anti-PD-1/PD-L1药物提供参考