07、poly-A内参和杂交内参（arrayanalysis的问题）

为了验证杂交的质量，Affymetrix公司加入了两类嵌入探针组：

一、poly-A内参：包括lys、phe、thr、dap

对应的探针组名称为：AFFX-r2-Bs-lys-3_at、AFFX-r2-Bs-dap-3_at、

AFFX-r2-Bs-phe-3_at、AFFX-r2-Bs-thr-3_s_at

（注意：一般只取3’的表达值）

期望检测到的信号强度为lys<phe<thr<dap

期望lys检测值（Detection Call）为P

以样品GSM362947_LTT.CEL和GSM362948_LTT.CEL为例：

1）获取lys、phe、thr、dap的信号强度

library(yaqcaffy)

rawData<-ReadAffy("GSM362947_LTT.CEL","GSM362948_LTT.CEL")

yaqcResult<-yaqc(rawData)

> yaqcResult@morespikes[grep("(lys|phe|thr|dap).*3",rownames(yaqcResult@morespikes), ignore.case = TRUE),]

GSM362947_LTT.CEL GSM362948_LTT.CEL

dap3         621.85881         618.93019

thr3         157.46776         141.04182

lys3          26.22679          24.34060

phe3          80.33482          78.98733

在这个例子中，两个样品的lys、phe、thr、dap信号强度都符合lys<phe<thr<dap

2）arrayanalysis的问题

用R语言软件arrayanalysis分析以上样品得出的结论却是：

这明显不符合lys<phe<thr<dap，这是为什么？

我们先来看看yaqcResult@morespikes是什么：

GSM362947_LTT.CEL GSM362948_LTT.CEL

b5           102.92636         123.20557

b3            98.75225         106.84035

bm           113.12133         129.45077

c5           298.87382         322.52600

c3           361.89032         421.07440

d5          1289.20872        1334.69642

d3          1489.85897        1702.89382

dap5         303.57364         156.58720

dap3         621.85881         618.93019

dapm         414.50848         333.24881

thr5         108.41316          39.60845

thr3         157.46776         141.04182

thrm         129.56930          98.51053

lys5          23.28581          21.26793

lys3          26.22679          24.34060

lysm          30.29455          28.88963

phe5          31.29219          12.49173

phe3          80.33482          78.98733

phem          47.31779          32.76261

在arrayanalysis的源码functions_imagesQC.R中，先用正则表达提取出yaqcResult@morespikes中符合"(lys|phe|thr|dap).*3"条件的：

> spnames<-rownames(yaqcResult@morespikes[grep("(lys|phe|thr|dap).*3", # only 3' !

+ rownames(yaqcResult@morespikes), ignore.case = TRUE),])

> spnames

[1] "dap3" "thr3" "lys3" "phe3"

注意到spnames的顺序是"dap3" "thr3" "lys3" "phe3"而不是"lys3" "phe3" "thr3" "dap3"

然后把名称为spnames的探针组也就是"dap3" "thr3" "lys3" "phe3"的信号强度赋给sprep

> sprep<-t(yaqcResult@morespikes[spnames,])

> sprep

dap3     thr3     lys3     phe3

GSM362947_LTT.CEL 621.8588 157.4678 26.22679 80.33482

GSM362948_LTT.CEL 618.9302 141.0418 24.34060 78.98733

sprep的数据就直接用来作图了，所以上图的信号强度趋势的顺序应该是dap、thr、lys、phe，而不是预想的lys、phe、thr、dap

（现在我所使用的arrayanalysis版本确实存在这个问题，但是也许以后会改进）

3）获取lys的检测值：

calls<-detection.p.val(rawData)$call

lysCall<-calls[rownames(calls)[grep("AFFX-r2-Bs-lys-3_at",rownames(calls), ignore.case = TRUE)],]

> lysCall

GSM362947_LTT.CEL.present  GSM362948_LTT.CEL.present

"P"                       "P"

结论：两个样品的lys的检测值都为P

二、杂交内参：包括BioB、BioC、BioD、CreX

对应的探针组名称为：AFFX-r2-Ec-bioB-3_at、AFFX-r2-Ec-bioC-3_at、

AFFX-r2-Ec-bioD-3_at、AFFX-r2-P1-cre-3_at

（注意：一般只取3’的表达值）

期望检测到的信号强度为BioB<BioC<BioD<CreX

期望BioB检测值（Detection Call）为P

以样品GSM286756.CEL为例：

1）获取BioB、BioC、BioD、CreX的信号强度

library(simpleaffy)

qcResult<-qc(rawData)

> spikeInProbes(qcResult)

AFFX-r2-Ec-bioB-3_at AFFX-r2-Ec-bioC-3_at

GSM362947_LTT.CEL             6.625742             8.499409

GSM362948_LTT.CEL             6.739313             8.717931

AFFX-r2-Ec-bioD-3_at AFFX-r2-P1-cre-3_at

GSM362947_LTT.CEL             10.54096            12.37574

GSM362948_LTT.CEL             10.73377            12.48219

在这个例子中，两个样品的BioB、BioC、BioD、CreX信号强度都符合BioB<BioC<BioD<CreX

2）获取BioB的检测值：

> show(yaqcResult)

GSM362947_LTT.CEL   GSM362948_LTT.CEL

……

AFFX-r2-Ec-bioB-3_at_call  "P"                 "P"

……

结论：两个样品的BioB检测值都为P

三、计算poly-A内参和杂交内参的信号强度表达值采用了JustMAS算法，芯片中必须含有MM探针。除此之外，芯片中还要包含AFFX-r2-Bs-lys-3_at、AFFX-r2-Bs-dap-3_at、AFFX-r2-Bs-phe-3_at、AFFX-r2-Bs-thr-3_s_at、AFFX-r2-Ec-bioB-3_at、AFFX-r2-Ec-bioC-3_at、AFFX-r2-Ec-bioD-3_at、AFFX-r2-P1-cre-3_at探针组。不过这些步骤都由yaqc和qc函数完成了，读者不必过多关心JustMAS算法。yaqc和qc有一点不同，就是计算出信号强度表达值x后，yaqc会取2的x次方，qc则是2的x次方再取2的对数，也就是又变回x了。