MCP|ZWT|Precision de novo peptide sequencing using mirror proteases of Ac-LysargiNase and trypsin for large-scale proteomics（基于Ac-LysargiNase和胰蛋白酶的蛋白组镜像de novo测序）

一、概述

由于难以获得100%的蛋白氨基酸序列覆盖率，蛋白组de novo测序成为了蛋白测序的难点，由Ac-LysargiNase（N端蛋白酶）和胰蛋白酶构成的镜像酶组合可以解决这个问题并具有稳定性，这2种消化位点互补的酶能够产生目标蛋白的镜像b,y离子，基于镜像原理设计的算法pNovoM可用于蛋白组de novo测序。

二、研究背景

De novo测序是基于二级质谱谱图解析未知蛋白、翻译后修饰及蛋白突变位点的测序方法，这项技术适用于没有氨基酸序列信息的蛋白及蛋白组解析。De novo测序的难点在于无法获得覆盖全部序列的子离子，尤其在噪音较高的情况下。为了增加子离子的覆盖，碎裂方法联用（CID/ETD、HCD/ETD、CID/HCD/ETD、EThcD）是de novo测序常用的手段，尽管联合碎裂能增加子离子的覆盖，这种方式对质谱仪的性能有很高的要求，ETD缓慢的扫描速度也降低了de novo测序的通量。PEAKS、PepNovo、NovoHMM、pNovo、OpenpNovo、pNovor、UVnovo、DeepNovo等算法的出现虽然改善了de novo测序的覆盖率，精确度和通量仍远远低于数据库检索。无论是哪种算法，都只有低于40%的肽段de novo测序结果与数据库检索结果相符。有报道将Lys-N、Lys-C、LysargiNase、胰蛋白酶等4种酶对单抗做镜像消化，提高了测序的覆盖率，是一种可用于de novo算法开发的前处理方法。

三、实验设计

1. Ac-LysargiNase的制备及活性评价

以大肠杆菌表达LysargiNase，将LysargiNase乙酰化制备Ac-LysargiNase。以酵母菌、大肠杆菌为消化样品，将胰蛋白酶与Ac-LysargiNase的性能进行比较，对Ac-LysargiNase的活性做出评价。蛋白样品在胶内或以溶液态消化，肽段质量解析仪器为Thermo Electron公司的LTQ Orbitrap Velos质谱仪。

2. pNovoM算法的建立与评价

首先以22个被胰蛋白酶和Ac-LysargiNase同时鉴定到的肽段对肽段液相分离的保留时间校准，肽段保留时间的差异为4分钟，保证了镜像肽段间不会产生相同的二级质谱谱图。以pNovo+软件对肽段进行de novo测序，获得镜像碎片谱图。针对胰蛋白酶产生的谱图，Ac-LysargiNase产生的肽段母离子在pNovoM算法中按规则与之匹配，匹配度最高的母离子就是镜像离子。当匹配打分高于10，匹配的灵敏度和精确度将高于90%，匹配得分高于10 的2个母离子为镜像离子。pNovoM算法以离子间赖氨酸和精氨酸的质量差寻找镜像离子。pNovoM的测序结果将与pNovo+、PEAKS进行比较。

四、研究成果

Ac-LysargiNase在自消化和肽段鉴定数上优于LysargiNase，结合pNovoM算法，蛋白样品de novo测序准确度可接近100%。酵母消化物中有48%的肽段谱图可形成镜像离子，其中97%镜像离子可覆盖全部关联肽段。pNovoM算法共鉴定到来自3753个蛋白的21249个肽段，FDR为5%时，pNovoM鉴定到的谱图比pNovo+、PEAKS多44-152%。

文章亮点

制备了可与胰蛋白酶联合产生镜像b,y离子的Ac-LysargiNase，建立了基于镜像原理的算法pNovoM用于蛋白组de novo测序。