扩增子图表解读1箱线图：Alpha多样性

箱线图

箱形图（Box-plot）又称为盒须图、盒式图或箱线图，是一种用作显示一组数据分散情况资料的统计图。因形状如箱子而得名。在宏基因组领域，常用于展示样品组中各样品Alpha多样性的分布

第一种情况，最大或最小值没有超过1.5倍箱体范围

第二种情况，最大或最小值超过1.5倍箱体范围，外位延长线外，即异常值(outliers)

 

Alpha多样性

知识背景：Alpha多样性计算方法 

常见的丰度估计方法有Shannon, Chao1和Observed OTU和PD whole tree等。我最喜欢用Observed OTU结果为整数，但只有物种种类信息，没有丰度信息，数值范围一般为几百至几千不等，范围很大，与研究对象有关；大家最常用的Shannon index 数值为1-10左右的小数，是综合物种数量和丰度两个层面的结果；Chao1是根据出现1/2次的OTU来估算总体；还有PD whole tree是考虑物种进化关系权重，认为分类学上非常上近的物种存在一定相关性；详细计算方法见：Alpha diversity measures

 

示例1

http://www.pnas.org/content/112/8/E911.short

这篇文章分析了水稻根不同区域的细菌组成，16S分析文章较系统的作品，两年被引用147次，推荐阅读 

图1.B 箱线图展示样品内的多样性(Alpha diversity)

- 图中元素解释

Y轴标签Estimaated species Richness代表估计的物种丰富度信息，刻度范围从0-2000可能代物OTU数量，高低对应物种丰富度即数量的高低；根据我的理解Y轴的刻度应为Observed OTU(即直接统计测序样品中按97%聚类16S的种类，虽然作者説是Shannon)；
X轴将标签放在了上方(更常见位于下方)，分别代表三个地区，作者采用按地区先分组，因为不同地区环境差异较大，一般先把主要差异因素分开；其次，这篇文章更关注的是水稻不同部分的微生物组，不是部分要在同一地点下进行比较才是单因素变化的分析；
右侧图例表示不同取样位置：从上到下分为土(Bulk Soil)、根际(Rhizosphere)、根表(Rhizoplane)和根内(Endosphere)四类，对应图中每个地区中箱体的不同颜色；
图中颜色箱体代表该组数据中间50%的分布区间，中间线为中位数，上下延长线端点分两种情况：如果范围小于1.5倍箱体则为最大或最小值；否则最远为1.5倍箱体长度的线。
图表意义：从不同地区看，可以看到多样性差别，代表土壤和环境条件可以影响微生物组；从取样的不同部分看，发现多样性差别极大，且不同地区有相同趋势；
图观察规律或结论：从根际-根表-根内，细菌的多样性逐渐下降的。不同地区的差别小于不同部分的差别。

 

示例2

Beckers, B., et al. (2017). Microbiome 5(1): 25.

这篇文章分析了白杨树不同区域的细菌组成和差异，16S分析中非常中规中矩，而且没有任何后续实验，但在今年还能发这么好的杂志，大家可以分析一下原因

 

图2. 箱线图展示细菌群体的Alpha多样性。四个箱体分别代表根际土(Rhizosphere soil)、根内生菌(Root endosphere)、茎内生菌(Stem endosphere)、叶内生菌(Leaf endosphere)。

- (A) 采用Observed OTUs方法估计OTU丰富度(richess)，即有多少物种；

- (B) 采用Pielou方法估算OTU的均匀度(evenness)，即各OTU相对丰度间关系；是一种常见enenness指数算法，计算方法是将Shannon-Wiener熵除以OTU数量的自然对数；一般生态学领域比较关注，功能研究者更关注最终的差异OTU；

- (C) 使用反向Simpson指数计算多样性(diversity)，是mothor中的方法，来自dominance指数的变形，而dominance计算为每个OTU比例平方再求合，与shannon的方法类似，原理是想用一个数代表整体群体中每个OTU的数量和丰度信息(richness和evenness)，我更常用Shannon方法；

- 差异分析：整体上使用ANOVA统计，存在显著差异，P<0.0001；图中字母代表组间组间Turkey两两比较的结果，相同字母的箱体代表组间无显著差异，而不同字母组间存在显著差异；有时会出现同一组出现2个字母的情况，是一种过渡状态，与这两个组均无显著差异。

- 图片优点：(A) Observed OTU数量展示使用了截断图，因为根际土中微生物数量是非常大的，而内生菌种类很少，使用截断图减少图中留白更加美观；不同种组织的颜色选用与实物相近，使人产生亲切感(根深棕，茎浅绿和叶深绿)；

- 图片解读：根际土中细菌近千种；根中内生只有2-3百种(也有可能根没洗干净，技术上不容易区分根表还是根内)；茎和叶百种左右(其中部分也可能只是来自于表面或污染)；此外结果的排列给人传达了由外到内，由上到下有特种数量下降的趋势；

 

知识背景：主流的分析流程

 

1、PNAS作者使用QIIME分析流程；2010发表在Nature Method上，被引7689次，是目前比较主流的分析方法，而且持续的维护和创新，目前正在开发QIIME2

2、Microbiome作者的分析流程为mothur，2009年发表目前被近7000次；

3、另外主流的的软件是Usearch，2010年发表在Bioinformatics，目前引用4947次；原来只是一个小小的高速序列聚类和比对软件，目前被作者开发成了扩增子分析流程，其中的关于序列聚类的算法UPARSE由作者单枪匹马发表在Nature method上，被引1424次；其实QIIME的聚类和比对默认都是使用此软件，核心算法是目前的主流；推荐使用。 

优点：作者一直在更新；体积小巧；安装方便，依赖关系极少(安装过QIIME的应该都想哭);
缺点：64位版收费(这么好的软件，收费也值得买)；部分功能还需使用QIIME脚本，估计将来可以全自己搞定，因为作者太强大