I类HDACs是乳酸化修饰“eraser”

赖氨酸酰化修饰 (lysine acylation) 是一种广泛存在的、进化上高度保守的蛋白质翻译后修饰 (post-translational modifications, PTMs) 类型，通过表观遗传调控等方式，影响多种生理、病理进程。目前已知，代谢物质可以通过多种途径影响赖氨酸酰化修饰 [1]，例如（1）脂肪酸活化形成脂酰CoA后，如乙酰CoA、琥珀酰CoA、β-羟脂酰CoA等，在组蛋白乙酰基转移酶 HATs 和组蛋白去乙酰化酶 HDACs作用下，以酶促反应途径调节蛋白质赖氨酸特定修饰水平；（2）某些二羧基脂酰CoA，如琥珀酰CoA、戊二酰CoA、3-甲基戊烯二酰CoA等，可通过分子内催化生成游离CoA-SH和高反应性环酸酐，以非酶促反应方式直接修饰赖氨酸；（3）其他代谢物，如NAD⁺、α-酮戊二酸，作为重要的辅助因子，还可以通过影响 (去) 修饰酶活性以调节PTMs。

乳酸 (lactate) 是细胞糖酵解途径重要的含碳代谢产物，它的生物学功能因肿瘤细胞中Warburg effect的存在，而得到了研究广泛关注。 作为一种手性化合物，乳酸通常以3种光学异构体形式存在，即D-体，L-体及外消旋体DL-体，其中，L-乳酸 (L-lactate) 是人体和大多数哺乳动物糖酵解代谢主要产生的物质，在肿瘤、败血症、自身免疫性疾病等病理状态下显著增多，最高可达40 mM。最新研究表明，与其他脂肪酸类似，L-乳酸也可以形成相应的脂酰辅酶A —— L-乳酰CoA (L-lactyl-CoA)。更为重要的是，芝加哥大学赵英明教授则在Nature上首次报道，乳酸是重要的表观遗传调控分子，在“writer”组蛋白乙酰基转移酶p300作用下，使组蛋白发生乳酸化修饰 K (L-la)，调控免疫激活过程中巨噬细胞极化相关基因表达 [2, 3]。然而，目前有关K (L-la) 的调控机制研究尚处于初期阶段，乳酸化修饰“eraser”仍未见报道。

另一方面，细胞中D-乳酸 (D-lactate) 主要经由乙二醛酶代谢甲基乙二醛 (MGO) 等具有高糖化活性的α羰基醛产生，尽管正常细胞中D-乳酸浓度低至 nM级，但在特殊情况下 (如短肠综合征)，血液中D-乳酸浓度也可达到3 mM。值得注意的是，有报道指出，乙二醛酶代谢中间产物——乳酰谷胱甘肽 (LGSH) 也可以通过非酶促反应的方式，直接修饰赖氨酸导致K (D-la) [4]。但是，K (L-la) 和 K (D-la) 之间存在怎样的相互联系，现在却未有研究正面回答。

2021年3月，在生物预印本bioRxiv上传的题为“Class I Histone Deacetylases (HDAC1‒3) are Histone Lysine Delactylases”研究文章中，芝加哥大学赵英明教授携手哥本哈根大学Dominique O. Gaffney教授等研究人员首次详尽检测了所有18种HDACs对乳酸化修饰的潜在调控作用，发现 Ⅰ类HDACs (HDAC 1-3) 是体外最有效的赖氨酸乳酸化修饰“eraser”，其中HDAC1和3也在细胞中发挥去乳酸化活性。与此同时，研究人员还列出了多条关键证据，讨论了K (L-la) 和 K (D-la) 之间的潜在联系。景杰生物为此项研究提供了一系列修饰抗体，如乳酸化修饰抗体 (PTM-1401, 1406, 1407)、乙酰化修饰抗体 (PTM-101)、巴豆酰化修饰抗体 (PTM-501) 等。

一、组蛋白乳酸化修饰是K (L-la) 而非K (D-la)

在回答组蛋白乳酸化修饰到底属于哪种类型时，研究人员在文中列举了以下五条证据：（1）细胞内L-乳酸浓度远远大于D-乳酸；（2）L-乳酸可以直接增强组蛋白乳酸化修饰；（3）组蛋白上赖氨酸乳酸化修饰位点是特异性存在的；（4）K (D-la) 仅发生于与LGSH密切接触的胞浆蛋白质中；（5）斑点印迹实验表明泛乳酸化修饰抗体识别K (L-la) 的特异性明显高于K (D-la) (图1B)。因此，研究人员认为组蛋白乳酸化修饰是K (L-la) ，而非K (D-la) (注：下文中乳酸化修饰均为L-乳酸化，除非特别强调)。

图1  在体外，HDACs对乳酸化修饰的影响

二、HDAC1-3是主要的乳酸化修饰“eraser”

随后，研究人员发现，HEK293T细胞裂解物可以将乳酸化修饰基团从组蛋白赖氨酸ε-氨基上移除，而广谱HDAC抑制剂TSA同样引起了去乳酸化修饰作用 (图1C)；值得注意的是，体外实验中，重组蛋白HDAC1-3可以导致荧光耦联肽段p53_317-320发生去乳酸化修饰 (图1D)；此外，HDAC1-3和SIRT1-3还可引起组蛋白 (包括H3K18和H4K5) L-乳酸化修饰水平降低 (图1E)。以上这些体外实验结果初步提示，常见的去乙酰化酶HDAC1-3和SIRT1-3也具有去乳酸化修饰能力 (HDAC1-3效力最强)，其中，HDAC3同时是最有效的L-和D-乳酸化修饰“eraser” (图2)。

图2  HDAC1-3对L-和D-乳酸化修饰的影响

三、HDAC1和3在细胞中发挥去乳酸化修饰作用

进一步研究发现，广谱HDAC抑制剂 (丁酸钠/TSA) 和HDAC1-3特异性抑制剂Apicidin处理Hela细胞都引起了全蛋白乳酸化修饰水平的增加，但是IIa HDAC抑制剂TMP195和sirtuin抑制剂NAM却不能对乳酸化修饰水平产生影响，进一步验证了HDAC1-3是乳酸化修饰的“eraser”。更为严谨地，研究人员进一步在Hela细胞中分别过表达HDAC1-3，这虽然未在整体层面上影响组蛋白乳酸化修饰，但却明显降低了H4K5乳酸化修饰水平；相反地，RNA干扰HDAC1则能明显增加H4K5乳酸化修饰水平，而干扰HDAC2 表达则未对H4K5乳酸化产生影响。以上这些结果不仅表明HDAC1和3是细胞中主要调控组蛋白赖氨酸ε-氨基乳酸化的“eraser”，与此同时，也暗示着乳酸化修饰位点调控特异性以及其他“eraser”的存在。

图3 细胞中HDAC1-3对乳酸化修饰的影响

四、HDAC3催化多种赖氨酸修饰能力的比较

除了介导去乙酰化、乳酸化修饰作用外，近期研究表明，HDAC3同样参与赖氨酸巴豆酰化、β-羟基丁酰化修饰基团的去除过程。于是，研究人员随后在体外实验中比较了HDAC3对多种PTMs的催化效率，结果发现，HDAC3催化去L- 和D-乳酸化修饰活性最低，而I类HDAC结构中存在的组氨酸H134也使得其更倾向于结合K (D-la)。

图4 HDAC3对多种PTMs的催化效率比较

总而言之，此项研究中利用荧光标记肽段、重组蛋白HDACs、Hela细胞系等多种实验材料，首次系统性地探索了乳酸化修饰“eraser”，揭示了I类HDACs (HDAC1-3) 和SIRT1-3 的去乳酸化修饰活性，并且深入探讨了HDAC1-3对细胞组蛋白乳酸化修饰的调控作用，这些结果为未来实现乳酸化修饰的精细调控奠定了坚实的理论基础。最后，我们也祝愿此项乳酸化修饰里程碑式研究能够在不久的将来顺利正式发表。

参考文献：

1. Gianluca Figlia, Philipp Willnow, and Aurelio A. Teleman, et al., 2020. Metabolites Regulate Cell Signaling and Growth via Covalent Modification of Proteins. Development Cell.

2. Di Zhang, et al., 2019. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature.

3. Erika L. Varner, et al., 2020. Quantification of lactoyl-CoA (lactyl-CoA) by liquid chromatography mass spectrometry in mammalian cells and tissues. Open Biol.

4. Dominique O. Gaffney, et al., 2020. Non-enzymatic Lysine Lactoylation of Glycolytic Enzymes. Cell Chem Biol.

5. Carlos Moreno-Yruela, et al., 2021. Class I Histone Deacetylases (HDAC1–3) are Histone Lysine Delactylases. bioRxiv.