扩增子图表解读3热图：差异菌、OTU及功能

热图是使用颜色来展示数值矩阵的图形。通常还会结合行、列的聚类分析，以表达实验数据多方面的结果。 

热图在生物学领域应用广泛，尤其在高通量测序的结果展示中很流行，如样品-基因表达，样品-OTU相对丰度矩阵非常适合采用热图呈现。

 

热图优点

 

因为人读数字需要思考和比较，而对颜色识别能力非常强，采用颜色的深浅代替数据表是非常高效的呈现方式，也便于从中挖掘规律。 

热图在非常小的区域展示了大量的基因表达/细菌丰度数据，即可以快速比较组间的变化，同时还可以显示组内每个样品的的丰度，以及组内各样品间的重复情况。

 

热图数据的转换

 

如果使用原始相对丰度或表达值，范围通常为0-100或0-1000000，而大部分的OTU或基因较低，做出的图会使绝大数据的数量颜色处于低丰度区，很难发现规律；因此需要数据变换，常用的方法有两类： 

1. log2(x+1) x为丰度或表达值 

为什么要原始值+1，是为了保证结果仍为正值，因为2的0次方为1； 

为什么要使用log变换，以log2为例，0-1000的表达范围，经变化为0-10的范围，颜色梯度范围更容易使人与数值建立对应关系。 

为什么常用log2对数变化，因为筛选差异的标准通常为两倍，log2对数变化后，每相差1的两个值都有两倍差异，选择目标很方便；有时也会根据具体情况，选择ln， log10等转换方式； 

2. Z-score标准化： 

标准分数（standard score）也叫z分数（z-score）,是一个分数与平均数的差再除以标准差的过程。用公式表示为：z=(x-μ)/σ。其中x为某一具体分数，μ为平均数，σ为标准差。此种方法可以使有差异且稳定变化的两组明显区分为不同的颜色，但却丢失了原始相对丰度、差异倍数的信息。但由于结果比较美观，规律明显，使用较多。

 

常用热图绘制工具

 

最常用的是R语言的包，如heatmap和pheatmap等。

此外Excel, matlab也可以。

不想学语言的可以使用一些专门绘制工具，如HEMI，个人用过，绘图和聚类都很方便，但偶尔会崩溃，不知现在作者更新没有

 

用R绘制热图的教程

 

网上教程很多，因为这个太常用。我推荐”生信宝典”最新发布的教程三步曲，从入门到精通。

1. R语言学习 - 热图绘制 (heatmap)

2. R语言学习 - 热图美化

3. R语言学习 - 热图简化

 

看图实战(Result)

 

示例1. OTU相对丰度 - 样品

Castrillo, G., et al. (2017). Nature. 

2017新出炉的Nature文章，Jeffery Dangl组作品。这篇文章分析拟南芥细菌组在低磷条件下参与磷吸收，有规律发现，有实验验证，绝对前沿的微生物组研究，正文每一个组图都相当于10分文章的工作量，专业而细致，推荐阅读

图2有7个子图，信息量非常大，我只说其中的e图

图2.e 重组菌体系在不同样品中各菌的相对丰度。

1. 图中元素解释

- X轴标签isolate上面的名称为实验用菌的编号；本实验为人工重组微生物组体系，标签为作者定义的菌编号。自然微生物组鉴定体系一般会聚类为OTU-1/2/3…样式编号；

- 右侧Y轴标签为实验组的名称，共分两列：第一列为材料基因型名称，如Col-0, phf1等；第二列为条件，本实验中为磷浓度；两者组合为一个实验组，每个实验组每组均为6次生物学重复，其中接种起始混合液Inoculum有4次重复；

- 左侧颜色图例Abundance(%)，来表示图中颜色的深浅所对应的数值范围，即白色为0，由浅到深连续变化范围，其中刻度对应的颜色丰度为0.01%， 0.14%和2.71%，至最深红棕色；

- 主图区中深浅的色块，代表每组样品每个菌相对丰度的值。

2. 图表结果：展示人工重组菌(起始接种Inoculum浓度相近)在不同实验组中发展成细菌群落后的相对丰度，发现突变体中一些菌的相对丰度发生变化；

3. 经验和技巧：一般OTU或菌的丰度间重复不是很好，尤其是自然样品丰度差异大，需要经过对数变换或做Z-score标准化；而本实验是重组体系，起始菌浓度相当，比较适合原始值直接绘制热图；此外，在扩增子研究中，实验个体间波动很大，一般热图呈现规律不明显，如上图，所以低水平文章很少用，一般只有顶级杂志敢用，尊重事实，尊重个体差异，相信统计上的差异。下面一篇文章也是如此

 

示例2. 热图+样品聚类展示菌相对丰度(log2%)

 

Lebeis, S. L., et al. (2015). Science

这篇文章也是Dangl组的，是最早植物人工重组菌群的文章，研究了植物水杨酸对微生物组的影响，开山之作值得阅读

图2C. 热图展示丰度显著差异的菌在所有样品中的相对丰度(相对丰度百分数%经log2对数变换)

1. 图中元素解读

- 左侧聚类图为所有样品聚类的结果，左上角的图例代表三大类样品，紫、灰和绿它们分别代表接种菌、土壤和根样品，颜色标签在热图中第一列，用以区分样品组； 

- 右侧为图的主图区，展示左侧样品中对应筛选的14个差异丰度菌的相对丰度值，丰度值百分比采用log2转换来缩小数据范围，并按从小到大对应的颜色梯度为蓝、白、红，即越红越高，越蓝越低。对应的图例为下方左上角的Color Key;

- 右侧正文区上方红上或蓝下箭头，代表这些菌的表达样式，为上调或下调，对应的图例为下方图例区的左下方(EC-enriched/depleted)；

- 右侧正文区下方菌的标签上还有颜色，对应最下面图例区的菌门信息；同时菌还继续分为两类，稳定定殖者(Robust Colonizers)和偶然或非定殖者(Sporadic or Non-Colonizers)。

2. 图表结果：图中展示了人工重组的菌在接种后，也可以形成丰度各异的微生物群体，并与自然条件下很多样式保持一致。

4. 图表结论或规律：受水杨酸调控差异表达的菌，可以在人工重组实验中得到验证。

5. 图片优点：配色采用红白蓝，比较严肃；图中添加了聚类信息、分组信息和菌分类为信息，极大的增加了图片的信息和可读性。有些热图信息量大，标签太小或根本无标签导致理解困难，此图的做法值得学习。